小麦类过敏反应突变体对氮素的响应及对白粉病的抗性

施 璇，李 磊，郑 彤，骆 孟，李 韬

(扬州大学江苏省作物遗传生理国家重点实验室培育点/粮食作物现代产业技术协同创新中心/教育部植物功能基因组学重点实验室/小麦研究中心，江苏扬州 225009)

植物过敏反应(hypersensitive reaction,HR)指植物和病原菌不亲和互作后，细胞快速坏死的抗病反应，而小麦类过敏反应(hypersensitive reaction-like,HRL)是指植株在无病害侵染也未受逆境或损伤的条件下，叶片上自发形成与病原物侵染后过敏反应类似的性状，也称为拟坏死(lesion mimic,LM)，它们与植物抗病及细胞程序化死亡相关[1]。HRL性状对维持植物的广谱抗性至关重要(广谱抗性是指对同一病原菌的不同生理小种或不同病原菌都具有抗性)。HRL现象最早在玉米中被发现，随后在大麦、拟南芥、水稻等植物上也相继报道了该表型的突变体[2]。

很多证据表明，大部分控制HRL性状的基因参与了过敏性反应以及植物抗病信号转导途径，该类基因表达往往与植物广谱抗性直接关联，绝大部分表现为对某一病原菌的所有已知生理小种都有抗性。例如，拟南芥的HRL突变体lsd1和acd与野生型相比较，能够显著提高对细菌和霜霉病菌的抗性[3-5]。大麦HRL突变体mlo对所有已知的大麦白粉菌均表现优异的抗性[6]。水稻HRL突变体cdr1、cdr2、cdr3和ebr3对稻瘟病菌表现高抗，而另一个单基因细胞核隐性水稻类病变坏死突变体lmm1对纹枯病真菌具有较野生型更强的广谱抗性[7]。

小麦HRL突变体的研究水平远远落后于其它作物。Kamlofski等[8]用EMS法处理阿根廷小麦品种获得HRL突变体，该突变体高抗小麦叶锈病，而且不影响产量；Anand等在小麦中转入几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因，转基因小麦在叶片上出现类似过敏性反应的坏死斑，有HRL表型的转基因植物提高了对锈病和赤霉病的抗性[9]。Li等[10]通过混池转录组测序的方法发现，二萜化合物相关的压力应激反应介导了类过敏反应性状和广谱抗性的产生，而氧化磷酸化、蛋白酶解体和光合途径与小麦类过敏反应表型相关。

氮肥是影响小麦产量和籽粒品质的重要物质，由于其显著的增产作用，在过去的几十年中，氮肥消耗量在我国农业生产资料投入中保持着持续增长的趋势[11]。然而，早在上个世纪的研究即表明，过多的施用氮肥不仅造成作物品质下降和污染环境，还可能加重作物的病害。杜 娟等[12]研究表明，高氮肥使大麦白粉病严重度和病情指数极显著升高。水稻白叶枯病属于典型高氮病害，过量施用氮肥能加重该病的发生，低氮胁迫则提高感病品种对白叶枯病的抗性[13]。随着施氮水平的提高，抗白粉病和霜霉病的植保素的合成量减少，从而增加了小麦白粉病和霜霉病的严重度[14]。过多的氮素供应降低了作物的抗病性已成为一个共识，研究者多从作物群体结构和生理指标两个方面来解释氮素通过何种途径降低作物的抗病性。在作物群体结构方面，过多的氮素供应导致群体密度过大，通风透光差，增加了田间湿度，有利于病原菌的侵染和繁衍。从生理指标看，过多的氮素供应可能提高了植株外质体中氨基酸和酰胺的浓度，降低了木质素含量以及硅的积累，从而导致植物抗病性的降低[15]。但迄今为止，氮素影响植物抗病性的分子机制的研究鲜有报道。

由专性寄生真菌小麦白粉病菌(BlumeriagraminisDC f. sp.tritici)引起的小麦白粉病是中国和世界上许多国家小麦生产中危害日趋严重的病害之一[16]。培育抗性品种是防治白粉病的最为有效的方法。小麦对白粉病的抗性包括水平抗性和垂直抗性，遗传基础复杂，迄今为止，已发现了58个抗性位点、78个抗性等位基因[17]和100多个数量性状位点(QTLs)。小麦白粉病菌复杂多变的特性，易导致小麦单个抗病基因抗性的丧失。所以，培育广谱抗性品种对防控小麦白粉病流行至关重要。

宁7840是由江苏省农科院选育的一个多抗高代品系，对赤霉病、锈病和白粉病都具有良好的抗性。该品种携带HRL性状，之前将宁7840作为赤霉病和锈病的研究材料的报道较多，小黑麦中1RS染色体上存在条锈病、叶锈病、秆锈病和白粉病等抗性基因，李 韬等[18]发现宁7840的染色体中可能存在1BL/1RS易位，提高了对赤霉病的抗性。Li等[19]利用宁7840和Clark杂交得到的RIL群体在小麦的1BS上定位到一个抗叶锈病基因，但未见将宁7840作为研究白粉病材料的报道。 本研究通过对宁7840进行EMS诱变和连续选择，共筛选得到14个比野生型目标性状更为明显的突变体，对这14个突变体进行不同氮素水平的处理，调查氮素丰、缺条件下不同突变体的HRL表型、白粉病抗性、叶绿素含量以及氮肥吸收利用效率，旨在筛选高抗白粉病且氮肥吸收利用效率高的小麦突变体，从而减少化肥和农药投入，有利于粮食安全、环境安全和食品安全。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为多抗高代小麦品系宁7840(阿芙乐尔/安徽11号//苏麦3号)及其14个Mu4代HRL加强型纯合突变体。

1.2 试验方法

试验于2015-2016年在扬州大学温室内完成。盆栽种植宁7840和14个突变体，每盆定苗至6株。供试土壤取自稻茬田块表土，土壤中速效氮42.6 mg·kg-1，速效磷42.81 mg·kg-1，速效钾92.93 mg·kg-1，有机质10.05 g·kg-1。每个材料设4个氮肥(尿素,氮素含量≥46.0%)水平，分别为0 g、3 g、6 g和9 g(约相当于每公顷施纯氮0 kg、63 kg、126 kg和189 kg)，每个水平设置两个重复，每个重复两盆，氮肥(尿素，含氮量≥46.0%)在小麦苗期以基施的方式一次性施入。

1.2.1 植株全氮含量的测定和氮肥吸收利用效率的计算

在小麦拔节期和成熟后分别取样，成熟期的秸秆和麦穗分别收获，拔节期样本先在105 ℃烘箱中杀青1 h，然后75 ℃烘干；成熟期样本直接在75 ℃烘箱中烘干，然后粉碎。每个材料设置两个重复，每个重复称量1 g，采用KDY-9830全自动凯氏定氮仪自动定氮法测定硫酸-混合加速剂消煮后的样本全氮含量(mg·g-1)。

氮肥吸收利用率=(氮处理植株吸氮量-缺氮处理植株吸氮量)/施氮量[20]。

1.2.2 叶绿素含量的测定

在小麦孕穗期用SPAD仪(SPAD-502)测量每盆每株小麦旗叶的叶绿素含量，每张叶片测上、中、下三个部分，取其平均值。

1.2.3 白粉病严重度调查

白粉病接种是将另一隔离温室中自发感染白粉病的拔节期小麦叶片剪下，直接将叶片上附着的白粉病病原菌抖落在盆栽中的小麦植株上，接种10～15 d后调查小麦植株的倒一(D1)、倒二(D2)和倒三叶(D3)的白粉病发病的严重程度(PIA)。白粉病严重程度根据孢子堆所占面积占D1、D2和D3叶面积的百分比进行估算，并对倒一叶、倒二叶和倒三叶的白粉病严重度分别赋值，评价值(PIA)=0.5*D1+0.3*D2+0.2*D3，PIA=0为免疫，0

1.3 数据计算及分析

氮含量、白粉病的严重度分布图用Excel 2007制作，基本描述性统计、方差分析和多重比较用Matlab软件(MathWorks Inc.,Natick,MA,USA)进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同类型突变体与施氮量的关系

类过敏反应表型在拔节期开始表达，在抽穗期表型最明显。在抽穗期调查发现，野生型及其14个HRL突变体植株对氮肥响应不同，根据其对氮肥的敏感性分为氮依赖型和非氮依赖型两种类型。野生型在低氮(0和3 g尿素·盆-1)条件下能够诱导HRL性状的提早表达，随着施氮量的增加，HRL性状会逐渐消失，因此属于氮依赖型(图1a)。在14个突变体中，有12个为氮依赖型，其中3个突变体(NMu-HRL-3、NMu-HRL-4和NMu-HRL-5)与野生型对氮肥的响应略有差异：野生型在3 g尿素·盆-1处理下，HRL性状开始消失，而这3个突变体在6 g尿素·盆-1处理下HRL性状才逐渐消失(表1)。另外，在高氮(6和9 g尿素·盆-1)条件下，有2个突变体(NMu-HRL-1和NMu-HRL-2)的HRL表型的叶面坏死病斑不会消失，为非氮依赖型(图1b)。

a：氮依赖型突变体；b：非氮依赖型突变体。CK:0 g尿素·盆-1；Trt1:3 g尿素·盆-1；Trt2:6 g尿素·盆-1；Trt3:9 g尿素·盆-1。下同。

a:Nitrogen-dependent mutants; b:Nitrogen-independent mutants; CK:0 g urea·pot-1; Trt1:3 g urea·pot-1; Trt2:6 g urea·pot-1; Trt3:9 g urea·pot-1.The same below.

图1不同类型突变体在不同氮肥处理下的表现型

Fig.1Differenttypesofmutantphenotypeunderdifferentnitrogenfertilizerlevels

表115个材料在不同水平氮肥处理下的表现型

Table1Phenotypesof15wheatlinesunderdifferentlevelsofnitrogentreatments

材料类型Materialtype材料名称MaterialnameCKTrt1Trt2Trt3氮依赖型Nitrogen⁃dependent宁7840Ning7840HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃3HRLHRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃4HRLHRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃5HRLHRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃6HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃7HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃8HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃9HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃10HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃11HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃12HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃13HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRLNMu⁃HRL⁃14HRLnon⁃HRLnon⁃HRLnon⁃HRL非氮依赖型Nitrogen⁃independentNMu⁃HRL⁃1HRLHRLHRLHRLNMu⁃HRL⁃2HRLHRLHRLHRL

2.2 两种类型突变体与植株含氮量和氮效率的关系

由图2可知，不同类型突变体在同一氮肥水平下植株含氮量不同：非氮依赖型突变体在不同时期的器官含氮量都在每盆施3 g尿素的条件下达到最高(图2a)，而氮依赖型突变体在不同时期的器官含氮量都随着施氮量的增多而升高(图2b)。氮依赖型植株成熟期穗部的含氮量极显著低于非氮依赖型植株(P=0.006)。

此外，两种类型突变体在不同时期器官的氮吸收利用效率和施氮量都呈负相关，拔节期的氮肥利用效率最高，成熟期次之(表2)。T测验结果表明，两种类型突变体间成熟期茎秆和叶片的氮肥吸收利用效率差异不显著(P=0.64)，非氮依赖型突变体的穗部氮肥利用效率显著高于氮依赖型突变体(P=0.02)。

a:非氮依赖型突变体；b:氮依赖型突变体。

a:Nitrogen-independent mutants；b:Nitrogen-dependent mutants.

图2两种类型突变体在不同时期的各个器官在不同氮肥处理水平下的含氮量

Fig.2Nitrogencontentsofdifferentorgansofthetwotypesofmutantsunderdifferentnitrogenlevelsatdifferentgrowthstages

表2两种类型突变体在不同氮肥处理下的氮肥利用效率多重比较结果

Table2Multiplecomparisonofthenitrogenfertilizerabsorptionandutilizationefficiencyintwotypesofmutantsunderdifferentnitrogentreatments

突变体Mutant处理Treatment拔节期地上部分组织Abovegroundtissueatelongationstage成熟期茎秆和叶片Stalksandleavesatmaturationstage成熟期穗部Earatmaturationstage非氮依赖型Trt15．84±0．36a3．81±0．24a4．96±0．31aNitrogen⁃independentTrt23．29±0．27b1．85±0．12b1．36±0．14bTrt31．91±0．09c1．11±0．10c0．89±0．09c氮依赖型Trt17．38±0．42a3．29±0．32a2．46±0．23aNitrogen⁃dependentTrt23．98±0．19b1．69±0．19b1．17±0．15bTrt32．84±0．18c1．29±0．16c0．75±0．06b

表中平均值后不同字母代表处理间的差异在0.05水平上显著。下同。

The different letters following the mean values indicate significant difference at 0.05 level.The same below.

2.3 两种类型突变体与叶绿素含量的关系

对两种类型突变体植株在不同氮肥水平处理下的叶绿素含量进行T测验，结果表明，低氮条件下两种突变体植株叶绿素含量的差异显著，非氮依赖型植株的叶绿素含量显著低于氮依赖型植株；虽然在每盆施9 g尿素条件下，非氮依赖型植株的叶绿素含量仍低于氮依赖型植株，但差异不显著(表3)，且两种突变体植株的叶绿素含量都随着施氮量的增加呈上升趋势。

相对而言，非氮依赖型植株的叶绿素含量随氮肥水平的上升呈直线上升，增幅比氮依赖型植株大，对照与每盆施6 g和9 g尿素处理间差异显著，三个施氮处理之间差异不显著；氮依赖型植株的叶绿素含量在对照和每盆施3 g尿素处理之间的升幅最大，在每盆施3 g、6 g和9 g尿素处理间的上升幅度趋于平缓，且处理间差异不显著。

表3相同氮肥水平下两种类型突变体的SPAD值及其T测验结果

Table3T-testresultsofSPADvaluebetweentwomutanttypesunderthesamenitrogenlevel

处理Treatment非氮依赖型SPAD值Nitrogen⁃independent氮依赖型SPAD值Nitrogen⁃dependentT值TvalueP值PvalueCK28．66±0．56a35．61±0．75a-3．29<0．01Trt133．54±0．84ab41．36±0．47b-3．39<0．01Trt238．28±0．75b42．39±0．85b-1．95<0．01Trt340．14±0．83b43．07±0．69b-1．360．18

2.4 两种类型突变体的白粉病严重度

T测验结果表明，非氮依赖型的白粉病严重度极显著低于氮依赖型(T=-7.59，P=2.72E-13)。在相同尿素处理条件下，两种突变体材料的白粉病严重度呈现不同的增长趋势。在不施氮的条件下，非氮依赖型突变体免疫白粉病；随着施氮量的增多，植株的白粉病严重度增加，每盆施3 g、6 g和9 g尿素处理下的植株白粉病严重度分别为5.64%、6.84%和7.25%(表4)。多重比较结果显示，非氮依赖型突变体的白粉病严重度在对照和每盆施3 g尿素处理间的差异不显著，但与每盆施6 g和9 g尿素处理间差异显著，三个施氮处理间的差异不显著。由此可见，虽然氮肥施用量的增多导致非氮依赖型小麦植株的白粉病严重度的加重，但在高氮条件下，非氮依赖型突变体依旧高抗白粉病。

表4两种类型突变体在不同氮肥水平下的白粉病严重度

Table4Powderymildewseverityoftwomutanttypesunderdifferentnitrogenlevels

处理Treatment非氮依赖型Nitrogen⁃independent/%氮依赖型Nitrogen⁃dependent/%CK0．00±0．00a0．45±0．01aTrt15．64±0．01ab58．93±0．34cTrt26．84±0．06b49．76±0．26bTrt37．25±0．12b48．24±0．53b

不施氮的条件下，氮依赖型突变体也免疫白粉病，并且在施氮和不施氮处理间差异显著。在施氮条件下，每盆施3 g与6 g、9 g尿素处理间差异显著，而每盆施6 g和9 g尿素两个处理之间差异不显著。与非氮依赖型突变体不同的是，高氮条件下，氮依赖型植株由原来的免疫白粉病变为中感白粉病。这些结果表明，在白粉病大流行的年份里，携带HRL性状的突变体能够有效地降低白粉病的发病率。

3 讨 论

研究表明，小麦不同生长时期吸收累积的氮量不同，同一生长时期不同器官氮素积累量也有较大差异[22]；小麦吸收的氮素在各器官中的分配也随着不同生育时期生长中心的转移而变化[23]。本研究根据材料对氮肥的敏感性，将携带HRL突变体分为氮依赖型和非氮依赖型。值得探究的是，虽然两种类型突变体在拔节期的地上部分和成熟期的茎秆的氮肥吸收利用效率差异不显著，但是非氮依赖型突变体的成熟期穗部氮肥吸收利用效率显著高于氮依赖型突变体。因此利用非氮依赖型突变体能够有效地提高氮肥的利用率，减少环境污染。

光合效率是构成作物产量的关键因素之一，叶绿素的含量决定了光合能力的强弱，提高作物的光合能力是作物增产的有效途径。一般认为叶片上的坏死病斑会影响植株的光合作用，本研究也表明低氮条件下，非氮依赖型植株的叶绿素含量显著低于氮依赖型植株，但在高氮条件下，两种类型突变体的叶绿素含量无显著差异。前人研究表明，植物的光合能力与植株体内的氮素营养水平呈正相关[24]。我们的实验结果也表明随着施氮水平的提高，两种类型突变体的叶绿素含量都呈上升趋势。非氮依赖型突变体的叶绿素含量在高氮处理下仍旧表现出高增长率，但是氮依赖型突变体的叶绿素含量在高氮条件下增长趋于缓慢。

对携带HRL表型的宁7840的研究表明，白粉病的抗性与HRL表型相关联，同时发现该表型受氮肥诱导，施用氮肥后该性状消失。郭露芳等[25]研究显示，在高氮水平下小麦白粉病病情指数显著高于低氮水平，我们也发现随着施氮量的增加，氮依赖性突变体的白粉病严重度随之增加，使植株由原先的免疫白粉病变为中感白粉病，当施氮量增加到一定水平(约126 kg·hm-2)，白粉病严重度反而下降，造成这一现象的原因可能和HRL的信号路径和氮代谢机理相关。本课题组之前的研究表明，在低氮条件下，携带HRL性状的小麦品系P7001的叶片表达该性状，并高抗白粉病；在充足氮的条件下该性状消失，P7001对白粉病的抗性也显著降低[26]，通过转录组测序的Pathway分析，植物与病原菌互作和植物激素信号传导这两条信号路径与HRL性状极显著相关，而增施氮肥能够降低作物的抗病性，氮肥的用量显著影响植物内源激素水平[27]，从而在高氮条件下影响HRL性状的表达。Wang等[28]发现一个小麦类过敏反应突变体HRL3，能够增强植株对白粉病的抗性，本研究也发现了两个增强型的HRL突变体为非氮依赖型突变体，在高氮条件下该表型未受影响仍高抗白粉病，为培育广谱抗性品种提供了新的资源。以上发现在白粉病病害大流行的年份能够最大效益地降低白粉病的损失，且对环境无害，但作用机理目前尚不清楚。

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