槲皮素对氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞炎症反应的影响

李海禹，孟哲，王琛，师强伟

（郑州大学第一附属医院心内科，河南 郑州 450000）

动脉管壁内的长期慢性炎症反应是促进粥样硬化的疾病发展过程的重要致病因素之一[1]。Toll受体家族（TLRs）是一组病原分子模式识别受体，与内毒素（LPS）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和热休克蛋白等内源性及外源性致炎物质结合，通过激活核转录因子（NF）-κB等核内转录因子上调单核细胞趋化蛋白（MCP）-1和肿瘤坏死因子（TNF）-α等多种炎症因子的表达，从而促进炎症反应过程。Toll受体4（TLR4）是被广泛关注的TLRs成员之一，在调节天然免疫和触发炎症级联反应方面具有举足轻重的作用[2]。研究表明[3]：抑制TLR4的过度激活可能是冠心病药物治疗的靶点。同时，槲皮素具有抗炎、抗肿瘤及抗氧化等多种生物活性作用。本实验旨在观察：槲皮素对抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌的炎症反应的细胞学机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

DMEM高糖培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清及real-time RT-PCR试剂盒（北京TransGen公司）；ox-LDL购于广东颐圆生物有限公司；槲皮素、青霉素、二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）、链霉素和噻唑蓝（MTT）（美国sigma公司）；MCP-1和TNF-α酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（美国R&D systems公司）；兔抗大鼠TLR4、髓样分化因子88（Myd88）、NF-κB（p65）、anti-TLR4及β-actin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.2 细胞培养及处理

分离8～10周SD大鼠胸主动脉，仔细剥离血管内膜及外膜，剪碎至1～2 mm3大小组织块，使用贴壁法培养。将细胞置于含12%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，其中含有100 U/mL浓度的青霉素和100 μg/mL浓度的链霉素，然后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中。待细胞融合至80%～90%时，用于以下实验。

1.3 实验分组

将细胞分为5组：A组（对照组）、B组（ox-LDL干预组）、C组（ox-LDL＋槲皮素50 μmol/L）、D组（ox-LDL＋ 槲 皮 素100 μmol/L） 和 E组（ox-LDL＋ 槲 皮 素200 μmol/L）。B～D组中ox-LDL的浓度均为100 μg/mL。

1.4 方法

1.4.1 将细胞按4×104/孔的密度接种于96孔板，按照前述细胞培养条件培养24 h备用，①应用MTT比色法测定不同浓度槲皮素的细胞毒性时，改用2%低血清培养基培养12 h后， 给予不同浓度槲皮素和ox-LDL（100 μg/mL）浓度干预24 h。吸去培养液，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL，微微振荡数次后，在全自动酶标仪上于570 nm处测定各组吸光值。②应用ELISA测定上清液中TNF-α和IL-1β的分泌时，换用无血清培养基孵育12 h。不同浓度槲皮素或anti-TLR4抗体及PDTC预处理1 h，再使用ox-LDL（100 μg/mL）刺激不同时间后，收集各组细胞上清液。依据操作说明，使用ELISA试剂盒测定MCP-1和TNF-α的分泌。使用自动酶联免疫吸附仪在450 nm处读取数值，绘制MCP-1和TNF-α的标准曲线，并依据此计算各实验组结果。

1.4.2 将各组细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板中，加入含血清培养基，待细胞密度达到80%～90%融合时备用。①应用实时定量聚合酶链式反应（PCR）测定TLR4和Myd88 mRNA表达时改用无血清培养基孵育12 h。换用不同浓度槲皮素预处理1 h，再给与100 μg/mL的ox-LDL刺激6 h，按照说明书使用Trizol（北京Transgen公司）提取各组总RNA。1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，分光光度计在260 nm处检测RNA的纯度。按照逆转录试剂盒（北京Transgen公司）操作步骤，将各组mRNA反转录为cDNA。使用Bio-Rad IQ5荧光PCR仪自带分析软件对real-time PCR结果进行分析。②应用Western-blot检测TLR4、Myd88和NF-κB（p65）蛋白表达时，改用无血清培养基孵育12 h。换用含不同浓度槲皮素无血清培养基孵育 1 h后，加入 ox-LDL（100 μg/mL）刺激 24 h。每孔使用200 µL RIPA裂解液提取蛋白。核内NF-κB（p65）蛋白使用核蛋白提取试剂盒提取。BCA蛋白定量试剂盒测定各组样品蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液并煮沸后，制作10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶进行电泳，半干转膜仪转膜。一抗浓 度 为 ：TLR4（1 ∶ 200）、Myd88（1 ∶ 400）、NF-κB（p65）（1∶ 500）和 β-actin（1∶ 2000）。以 β-actin作为内参照。化学发光法检测，图像采集，Quantity one软件进行图像分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度槲皮素细胞毒性测定

使用MTT法对不同浓度槲皮素干预的各组细胞进行测定后，在0～200 μmol/L浓度范围内，槲皮素均未显示明显的细胞毒性；仅给予细胞100 μg/mL ox-LDL孵育24 h后，也未出现明显细胞毒性。因此，在后续的试验中，选取50，100，200 μmol/L 3个浓度进行干预处理。结果如图1所示。

2.2 槲皮素对ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）MCP-1和TNF-α分泌的影响

ELISA结果显示：在给予细胞100 μg/mL ox-LDL刺激不同时间后，MCP-1和TNF-α的分泌明显上升，最高可达：1027.45 pg/mL和651.74 pg/mL。使用槲皮素预处理1 h后，可以有效减少MCP-1和TNF-α的分泌，最低可达：448.27 pg/mL和258.16 pg/mL，并呈现时间和剂量依赖性，如图2所示。

2.3 槲皮素对ox-LDL诱导的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信号通路的影响

Western-blot结果显示：使用100 μg/mL ox-LDL对VSMCs刺激24 h后，TLR4、Myd88和核内NF-κB（p65）的表达明显升高。槲皮素对细胞进行预处理1 h后，明显抑制ox-LDL诱导的TLR4和Myd88的高表达及NF-κB（p65）的核转位，并具有浓度依赖性。在mRNA水平上，槲皮素显著降低TLR4和Myd88基因的转录水平。提示：槲皮素能够有效的抑制TLR4信号通路的激活。结果如图3所示。

2.4 抑制剂对ox-LDL诱导的VSMCs MCP-1和TNF-α分泌的影响

为了进一步明确槲皮素对ox-LDL诱导的VSMCs炎症抑制作用是否部分依赖于TLR4信号通路，先使用anti-TLR4抗体和NF-κB（p65）特异性抑制剂PDTC对细胞进行预处理1 h，再给予ox-LDL刺激6 h或24 h。ELISA结 果 提 示 ：anti-TLR4抗 体 和PDTC均能够显著抑制ox-LDL诱导的MCP-1和TNF-α高表达，起到了与槲皮素相似的作用。以上结果提示：TLR4-Myd88-NF-κB（p65）信号通路的激活可能参与了ox-LDL诱导的VSMCs炎症反应过程。结果如图4所示。

图2 槲皮素抑制ox-LDL诱导的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

图3 槲皮素抑制ox-LDL诱导的VSMCs TLR4-Myd88-NF-κB (p65)信号通路的激活

图4 抑制剂减少ox-LDL诱导的VSMCs MCP-1和TNF-α的分泌

3 讨论

近年来，研究发现病理性的炎症反应通过加速泡沫细胞堆积、VSMCs凋亡及纤维帽降解等方式，不仅增加斑块的形成速度，同时也使已存在的稳定性斑块向易损性斑块转变，极大地影响着疾病的转归[4]。氧化应激是斑块内部炎症反应的重要特征之一。在斑块形成的初始阶段，低密度脂蛋白（LDL）首先聚集于斑块中央部位，随后经过一系列复杂的氧化修饰过程最终成为氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）[5]。Ox-LDL通过刺激巨噬细胞、内皮细胞和VSMCs释放多种炎症因子和趋化因子，促进了斑块的形成和失稳[6]。因此，ox-LDL被认为是一个强有力的致炎因子。

当与内毒素（LPS）、ox-LDL和AngII等内源性及外源性配体结合后，TLR4通过自身活化，将细胞外信号经由Myd88传导，进而引发NF-κB（p65）核转位，诱发靶向炎症因子转录水平升高[7]。在本实验中发现：ox-LDL能够诱导VSMCs的炎症因子过分泌，同时伴随TLR4、Myd88表达升高及NF-κB（p65）核转位增加，表明ox-LDL诱导的VSMCs炎症反应可能依赖于TLR4介导的炎症通路的激活。槲皮素能够有效抑制ox-LDL诱导的VSMCs MCP-1和TNF-α过分泌，并具有浓度和时间依赖性，显示出较强的抗炎作用[8]。同时，槲皮素可减少TLR4、Myd88的表达及NF-κB核转位，抑制TLR4介导的炎症通路的激活[9]。在使用anti-TLR4抗体及PDTC对TLR4和NF-κB进行特异性抑制后，也可以起到与槲皮素相似的抗炎作用。

以上结果提示：槲皮素可以有效地抑制ox-LDL诱导的VSMCs炎症反应，其抗炎作用可能依赖于对TLR4介导的炎症通路的调节。这为槲皮素用于粥样硬化性疾病的治疗提供了一定的分子学基础。

参考文献

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[4] 徐斌,张延斌,许旭光,等.TLR4/MAPKs信号通路在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞分泌MCP-1中的作用[J].中国病理生理杂志,2010,26(5):848-852.

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[9] 蔡谦谦,周红,张贵婷,等.oxLDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物促进脐静脉内皮细胞迁移及炎症因子表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2017,33(7):865-869.