ChIFN酿酒酵母工程菌冻干保护剂的优化

张冬生，刘 宗，宋 莉*，赵德刚，2*

(1. 贵州大学 生命科学学院 农业生物工程研究院 山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025；2. 贵州省农业科学院， 贵州 贵阳 550006 )

酿酒酵母中丰富的营养及活性物质，在改善动物胃肠道及免疫功能[1-2]、提升产品品质等方面发挥着重要的作用，故被广泛应用于医疗保健、饲料添加剂及食品生产等领域[3-4]。但在储存及制备过程中如何保持酵母的生物活性是限制其利用的关键因素，也是衡量产品质量的重要指标。而固态微生物制剂具有保藏期长、不易污染、便于运输贮藏和质量易控等优点[5，6]，因此广泛应用于微生物储存及保藏。生产中常采用真空冷冻干燥技术制备固态微生物制剂，但冷冻干燥过程中易结冰引起溶质变化及冰晶的形成，导致细胞结构[7，8]和酶分子钝化，导致细胞死亡[9]，影响细胞活力降低对产品的有效利用率。而冻干保护剂的使用可以有效的降低对细胞损伤，保持微生物原有各种理化特性[10，11]和生物活性，减少加工过程对细胞损伤。

故本文采用析因设计实验与响应面优化分析相结合的方法[12]，对实验室创制出具有抗病毒特性鸡干扰素(ChIFN)重组酿酒酵母工程菌的真空冷冻干燥保护剂进行筛选和优化，以期为该工程菌的应用和生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1工程菌株 表达鸡干扰素的酿酒酵母工程菌株(ChIFN)由贵州大学山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室创制。

1.1.2主要试剂及设备 酵母抽提物和蛋白胨均购自OXOID(英国)；半乳糖、乳糖、蔗糖 、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、半胱氨酸盐、β-环状糊精和脱脂奶粉等均购自北京索莱宝公司(北京)，Ura Minus Media购自北京范基诺科技有限公司(北京)；真空冷冻干燥机(FreeZone©4.5 Liter Freeze Dry Systems)为Labconco公司(美国)生产。

1.2 方法

1.2.1工程菌冷冻干燥及菌粉质量检测 将SC培养基中的工程菌诱导培养至稳定期，以4℃、5000 r/min离心10 min收集菌泥，按体积比1∶1的比例加入冻干保护剂并混合均匀，平铺于灭菌平皿中置于真空冷冻干燥机-80℃、真空度3～10 Pa条件下干燥8 h至含水量降至6%以下。采用次甲基蓝染色法[13]与血球计数法[14]对冻干菌粉质量进行分析，统计复水活菌数，按细胞存活率(%)=活细胞个数/(活细胞个数+死细胞个数)×100计算细胞存活率。

1.2.2单一冻干保护剂筛选 参考相关文献[15]选择和配制蔗糖、乳糖、海藻糖、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、硫酸锰、半胱氨酸盐、脱脂奶粉、明胶、β-环状糊精和吐温-80等13种保护剂，以无菌水作为对照，制备冻干粉并测定菌粉活力，每组实验重复3次。

1.2.3响应面试验设计与析因设计试验筛选复合保护剂 通过析因设计试验[16]筛选冷冻干燥过程中保护效果良好的保护剂。结合中心组合设计(Central-Composite Design，CCD)试验[17]进行二阶响应面模型拟合，以冻干工程菌存活率为响应值，预测最优复合保护剂配方并进行试验验证，以确定最佳复合保护剂配方。每组实验进行3个重复。使用Design Expert 8.0.5.0软件(Stat-Ease Inc.， Minmeapolis，USA)[18，19]进行试验设计与数据分析。

2 结果与分析

2.1 单一保护剂对工程菌存活率的影响

图1 单一保护剂对工程菌存活率的影响Fig.1 Protective effects of different cryoprotectants on the recombinant yeast

单一保护剂对细胞存活率的影响结果表明(图1)，脱脂奶粉、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、聚乙二醇的浓度为10 g/100mL、15 g/100mL、5 g/100mL、10 g/100mL、5 g/100mL、1 g/100mL，其对工程菌的保护效率分别为43.73%、37.78%、30.60%、29.25%、28.94%、28.45%。脱脂奶粉、蔗糖和海藻糖对工程菌的保护率均大于30%，而乳糖、甘油和聚乙二醇的保护率在25%～30%之间，其中七种单一保护剂的保护效率低于20%。

2.2 二水平析因试验设计及其结果

根据二水平析因设计(表1)，分析得到真空冷冻干燥过程中影响细胞存活率的主要保护剂及各保护剂之间的交互作用。结果表明(表2)，不同保护剂对菌粉的保护效果存在一定差异，7种保护剂中脱脂奶粉、蔗糖和聚乙二醇对工程菌的保护作用最大，其影响力为脱脂奶粉>聚乙二醇>蔗糖>蔗糖>甘油>甘露醇>明胶>β-环糊精，但甘露醇、明胶及β-环状糊精的影响系数均为负值，对细胞的冷冻干燥过程起到阻碍作用，因此可以去除这3种保护剂。为了降低冻干保护剂的成本选择脱脂奶粉、聚乙二醇和蔗糖3种保护剂为冻干过程的主要影响因子即主效应，进一步对3种保护剂的最佳配比进行优化。

表1 二水平析因试验设计及响应值Tab.1 Two - level factorial design and response value

表2 偏回归系数及影响因子的显著性分析Tab.2 Partial regression coefficients and analyses of their significances

2.3 响应面设计试验优化复合保护剂配方

通过对蔗糖、脱脂奶粉、聚乙二醇三种组分进行中心组合设计(表3)，得到相应的二次回归方程模型：Y=79.50-3.27×A+0.51×B+2.72×C-0.43×A×B-1.79×A×C-1.15×B×C-9.71×A2-7.05×B2-7.13×C2(R2=0.9805) 式中Y为响应值，及冷冻干燥后细胞存活率；A、B、C分别是蔗糖、脱脂奶粉和聚乙二醇浓度(g/ml)。式中多元相关系数R2=0.98，说明该模型对实际拟合度好；Prob(p)> F 值 小于0.0001(Prob(p)> F < 0.05 视为模型显著)，可用于响应值预测。

为了获得最佳的复合保护剂配比，因此建立理想数学模型进行保护剂分配及浓度优化。在中心组合设计基础上，进一步根据二次模型回归方程系数的显著性检验，结果表明(表5)，A和C因素对细胞成活率的线性效应显著，B因素不显著。因此在本试验设定的区域范围内，蔗糖与脱脂奶粉、蔗糖与聚乙二醇及脱脂奶粉与聚乙二醇的交互作用显著(Prob(P)>F <0.0001)，说明冻干保护剂两两之间的交互作用对工程菌在真空冷冻干燥过程具有显著的保护效果。

表3 中心组合设计及结果Tab.3 Center combination design and results

表4 中心组合设计二次模型方差分析Tab.4 Center Combinatorial Design Quadratic Model Variance Analysis

表5 二次模型回归方程系数及显著性检验Tab.5 Quadratic model regression equation coefficient and significance test

A、B：蔗糖和脱脂奶粉；C、D：蔗糖和聚乙二醇；E、F：脱脂奶粉和聚乙二醇

根据回归方程绘制影响因素两两交互作用的等高线及三维曲面图表明(图2)，曲线抛物面存在极大值，脱脂奶粉、蔗糖、聚乙二醇三个因素之间的交互作用明显，确定保护剂最佳水平范围。分析优化得到最佳的复合保护的配方，当蔗糖、脱脂奶粉和聚乙二醇配比分别为14.44 g/100mL、10.08 g/100mL和1.11 g/100mL时，工程菌实际存活率达到80.81%，接近79.50%(表3)的预测值。

3 结论与讨论

真空冷冻干燥技术在提升产品品质[20]、延长储存时间[21]和增加产品的活性等方面发挥着重要作用[22]，因此该技术得到广泛的运用。但冷冻过程冰晶极易造成细胞损伤，所以在该过程中引入不同种类的单一保护剂组成复合保护剂可以对工程菌起到有效保护作用，能明显的改善产品质量。

本试验选取13种冻干保护剂作为研究对象，单因素试验研究表明脱脂奶粉的保护效果最好(43.73%)，但仍难满足高质量标准菌粉的生产及应用要求。因此进一步通过二水平析因设计试验筛选13种冻干保护剂中影响细胞存活的主效应，并结合响应面设计试验优化得到最佳复合保护剂配方。研究发现脱脂奶粉、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油和聚乙二醇在作为单一保护剂时，对酵母细胞具有较好的保护效果[23]。其中脱脂奶粉、蔗糖和聚乙二醇3种冻干保护剂在冻干过程中的贡献作用最大，是组成的较为理想复合保护剂配方。剩余10种单一保护剂的保护效果较差，可能与保护剂的作用方式不同密切相关[24]，蔗糖与脱脂奶粉作为非渗透性保护剂，聚乙二醇作为渗透性保护剂，两种类型的保护剂相结合能实现互补，提高对酵母的保护作用，保证较高的细胞存活率。优化得到蔗糖、脱脂奶粉和聚乙二醇不同配比组成的复合保护剂保护率可达80.81%，说明该保护剂具有较好的保护效果。该复合保护剂具有组成简单、成本较低、操作简便等[25]优势，因此该研究为酿酒酵母在其他方面的应用提供了理论依据和技术支撑。

蔗糖、脱脂奶粉和聚乙二醇这三种保护剂的保护作用较为突出，能显著提高工程菌在-80℃、3～10 Pa真空度、干燥8 h、菌体含水量降至5.63%环境下的耐受能力，降低对细胞的损伤。优化得到保护剂配方为蔗糖14.44 g/100mL、脱脂奶粉10.08 g/100mL、聚乙二醇1.11 g/100mL。

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