Notch3、DLL1、CD133在结直肠腺癌中的表达及意义*

蒋海涛，王 红

(遵义医学院附属医院消化内科，贵州遵义 563003)

结直肠癌(CRC)是胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，由于饮食结构与生活方式的改变，近年来其发病率呈明显上升趋势，高居恶性肿瘤第3位[1-2]。目前研究认为Notch信号通路及肿瘤干细胞(CSCs)在CRC的发生、发展中起至关重要的作用。CSCs是一类具有干细胞特性的细胞亚群，能产生异质性肿瘤细胞；CD133表达于多种肿瘤干细胞表面，是目前研究较为深入的CRC干细胞标志物之一。Notch信号通路在细胞的增殖、分化、凋亡中发挥着至关重要的作用，与CRC密切相关。研究表明在CRC中，Notch信号的异常表达可促使肿瘤干细胞发展为CRC，并且在促进CRC干细胞的自我更新、分化、选择性吸收及分泌过程也起到重要作用。目前关于Notch信号通路与CD133在CRC中的研究很少，本研究利用免疫组织化学的方法检测50份CRC标本中Notch3、DLL1、CD133的表达情况，结合患者临床病理特征，旨在分析在CRC发生、发展的过程中上述指标的可能作用机制，探讨其与CRC浸润、转移的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院病理科2013-2015年手术切除后存档的50份结直肠腺癌标本，30例腺瘤标本(腺瘤组)，并取12份正常结直肠黏膜标本(正常组)。每份标本临床、病理资料完整，所有患者术前均未行任何抗肿瘤治疗，术后病理类型均经病理诊断证实。结直肠腺癌标本中，结肠腺癌30份，直肠腺癌20份，其来源患者中男25例，女25例，年龄26～77岁，中位年龄60岁，肿瘤直径大于或等于5 cm 35例，<5 cm 15例；高分化腺癌13例，中分化腺癌32例，低分化腺癌5例；19例伴淋巴结转移，31例不伴淋巴结转移；Dukes分级，A/B期标本28例，C/D期标本22例；浸润深度为T1/T2期标本8例，T3/T4期标本42例。

1.2主要试剂 兔抗人多克隆抗体Notch3及DLL1购自美国Abcam公司，兔抗人CD133多克隆抗体购自武汉博士德生物有限公司，DAB显色试剂盒购自上海基因科技有限公司。

1.3免疫组织化学法 所有蜡块标本连续切片，厚度约4 μm，经二甲苯室温下脱蜡、梯度乙醇水化、柠檬酸钠缓冲液高压修复等步骤后，使用免疫组织化学SP法染色，DAB显色，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。所用抗体浓度分别为：兔抗人Notch3多克隆抗体(1∶400)，兔抗人DLL1多克隆抗体(1∶400)，兔抗人CD133多克隆抗体(1∶200)。已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4结果判断 按照WOLFF等[3]及杨军等[4]推荐标准，首先在低倍镜下(放大100倍)阅览整张切片，察看目的细胞(腺癌/腺瘤/正常结直肠细胞)中阳性细胞的分布情况，摒除背景着色及非特异染色，选择高表达区域高倍镜下(放大400倍)进一步观察，计数5个高倍视野中细胞染色强度及阳性细胞数所占同类型细胞的百分比，根据染色结果，将染色强度分为4级。阴性：即无着色；弱阳性：小于10%的细胞出现不同程度的细胞质或细胞膜着色；阳性：10%～30%的细胞出现深棕褐色的细胞质或细胞膜着色，或小于或等于70%的细胞出现弱/中等强度的细胞质或细胞膜着色；强阳性：大于30%的细胞呈现强棕褐色的细胞质或细胞膜着色，或大于70%的细胞呈中等强度细胞质或细胞膜着色。

1.5统计学处理 使用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，各指标间相关性分析采用Spearman相关分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Notch3、DLL1、CD133的表达情况 Notch3蛋白主要表达于细胞质，呈棕黄色颗粒；在正常组、腺瘤组、腺癌组的阳性表达率分别为8.3%(1/12)、26.7%(8/30)、64.0%(32/50)，见图1、表1。Notch3在腺癌组的阳性表达率显著高于腺瘤组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05);在腺瘤组与正常组的表达，差异无统计学意义(P>0.05)。DLL1蛋白主要表达于细胞膜和细胞质，呈棕黄色颗粒；在正常组、腺瘤组、腺癌组的阳性表达率分别为16.7%(2/12)、33.3%(10/30)、68.0%(34/50)，见图2、表1。DLL1在腺癌组的阳性表达率显著高腺瘤组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05);在腺瘤组与正常组的表达，差异无统计学意义(P>0.05)。CD133蛋白主要表达于细胞质和细胞膜，亦呈棕黄色颗粒；在正常组、腺瘤组、腺癌组阳性表达率分别为8.3%(1/12)、36.7%(11/30)、54.0%(27/50)，见图3、表1。CD133在腺癌组的阳性表达率亦显著高于腺瘤组和正常组，差异有统计学意义(P<0.05);在腺瘤组及正常组的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2Notch3、DLL1、CD133蛋白的表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系 Notch3的表达与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、分化程度、浸润深度、肿瘤大小无关(P>0.05)；分别与Dukes分期和淋巴结转移有关(P<0.05)；伴有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，Dukes分期越高阳性率越高。DLL1的表达与肿瘤Dukes分期、浸润深度、淋巴结转移情况有关(P<0.05)，肿瘤的Dukes分期越高、浸润深度越深阳性率越高，伴有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组；与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、分化程度及肿瘤大小无关(P>0.05)。CD133的表达与肿瘤的淋巴结转移情况有关(P<0.05)，伴淋巴结转移组阳性率显著高于不伴淋巴结转移组；而与年龄、分化程度等其他临床病理资料无关(P>0.05)，见表2。

A:正常组;B:腺瘤组;C:腺癌组

图1 Notch在3组中的表达(×200)

A:正常组;B:腺瘤组;C:腺癌组

图2 DLL1在3组中的表达(×200)

A:正常组;B:腺瘤组;C:腺癌组

图3 CD133在3组中的表达(×200)

2.3Notch3、DLL1、CD133表达的相关性 在Notch3蛋白阳性表达的32份结直肠腺癌组织标本中，CD133蛋白的阳性表达率为85.2%(23/27)；在Notch3蛋白阴性表达的18份结直肠腺癌组织标本中，CD133蛋白的阳性表达率为22.2%(4/18)；Spearman相关分析法统计分析显示，在结直肠癌中Notch3与CD133表达呈正相关关系(r=0.478，P=0.000)。Notch3与DLL1及DLL1与CD133表达均无明显相关性，见表3。

表2 Notch3、DLL1、CD133蛋白表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系(n)

续表2 Notch3、DLL1、CD133蛋白表达与结直肠腺癌患者临床病理特征的关系(n)

表3 Notch3与CD133蛋白在结直肠腺癌中表达的相关性

3 讨 论

Notch信号通路和肿瘤干细胞是目前肿瘤研究的热点。Notch信号通路主要由5种Notch配体、4种Notch受体及转录因子CSL构成，5种Notch配体分别为DLL1、DLL3、DLL4以及Jagged1和Jagged2，4种Notch受体分别为Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。经典的Notch信号转导活化需经历3次裂解(S1、S2、S3)，产生Notch的活化片段NIC，NIC进入细胞核内并与转录因子CSL结合，共同形成转录活化复合体，从而调控下游基因的转录与表达。

Notch通路与多种实体肿瘤密切相关，大量研究表明，在CRC中Notch基因常出现异常表达。Notch3是Notch通路的受体之一，定位于19q12染色体；DLL1基因定位于6q27染色体，是Notch通路的配体之一。目前Notch3的研究主要集中在肺癌和卵巢癌，DLL1主要在神经系统疾病方面研究较多，在CRC中的研究均较少。研究指出激活Notch3信号通路可促进CRC细胞的生长及迁移[5-6]，而miR-206通过下调Notch3基因的表达使肿瘤的增殖与转移受到抑制[7]。本研究发现Notch3在正常结直肠黏膜组、腺瘤组、腺癌组中的表达呈逐渐递增趋势，表明高表达的Notch3与结直肠癌的发生、发展密切相关，且Notch3的表达与Dukes分期及淋巴结转移相关，提示Notch3与肿瘤的转移有关，与文献报道相符。DLL1在结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌中均高表达，在结肠癌中DLL1的阳性表达率约58%[8]；而本课题组前期的研究也发现，在结肠癌细胞HT-29中DLL1蛋白高表达，加用Notch信号通路阻断剂DAPT作用于该细胞后，其阳性强度和阳性表达率均明显下降[9]，进一步证实了DLL1的表达与CRC密切相关。本试验中DLL1在正常组织、腺瘤、腺癌中表达率逐渐升高，在腺癌中阳性表达率达68.0%，与既往文献报道相符，结合临床病理特征发现，DLL1的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期有关，提示其可能参与了CRC的发展及转移。对Notch3和DLL1的相关性分析发现，二者在结直肠腺癌中的表达并无明显相关性，提示在结直肠腺癌中Notch3和DLL1基因可能扮演致癌/促癌基因的角色，同时二者又互相独立，并无相互作用。通过图1及图2可以发现，与正常结直肠腺管比较，结直肠腺癌的腺管明显增粗，且细胞核排列紊乱、大小不一，提示Notch3和DLL1的高表达可能导致正常结直肠腺上皮过度增殖，并进一步导致CRC的发生。此外结合患者临床病理资料分析，Notch3和DLL1的异常表达可能与结直肠腺癌的发展、转移存在着某种关系，将有望成为新的肿瘤标记物推测结直肠癌患者的预后。

肿瘤干细胞是目前研究的热点，肿瘤干细胞学说认为，CSCs是肿瘤组织中具有干细胞特性的一类细胞亚群，能产生异质性肿瘤细胞，不仅具有自我更新与无限增殖能力，还具有多向分化潜能，是恶性肿瘤的起源。CD133表达于多种肿瘤干细胞表面，是目前研究较为深入的结直肠癌干细胞标志物之一。与癌旁正常组织相比，CD133在CRC中的表达明显升高[10]，且与淋巴结转移相关[11]，与本研究结果一致。HONG等[12]研究指出，CD133的表达与CRC患者临床病理分期及预后均密切相关。本研究发现，CD133在CRC组织中的阳性表达率明显高于腺瘤组及正常组，结合临床病理资料进一步分析，CD133在CRC中的表达与淋巴结转移有关，伴有淋巴结转移组阳性表达率显著高于无淋巴结转移组，说明CD133蛋白表达阳性的患者更易出现淋巴结转移，与文献报道相符。

Notch通路与CSCs关系密切，Notch信号在维持CSCs特性中发挥关键作用，Notch信号通路激活后有利于CSCs的自我更新和存活，刺激CSCs增殖，最终形成肿瘤。在髓母细胞瘤中，阻断Notch信号通路后，CD133表达阳性的细胞数量降低了5倍[13]。在CRC中，众多肿瘤干细胞标志物(如：CD133、CD44、LGR5、Hes1、MUSASHI-1等)的表达与Notch信号通路明显相关[14-15]。APOSTOLOU等[16]发现Notch受体在结肠癌干细胞中高表达，敲除不同的Notch受体对干细胞转录因子(Sox2，Oct4,Nanog)、CD44、Met原癌基因及二肽基肽酶-4均有不同程度的影响。本研究中，Notch3和CD133在CRC组织中均高表达，相关性分析显示，二者在结直肠腺癌组织中的表达呈明显正相关关系(r=0.478，P=0.000)，提示Notch3和CD133基因之间也许存在某种关联，Notch3信号通路是否通过对CSCs的调控而影响CRC的发生、发展，值得进一步研究。

综上所述，Notch3、DLL1、CD133的异常表达参与了CRC的发生、发展过程，了解Notch3、DLL1、CD133蛋白的表达情况，对于评估CRC的发展及预后具有重要意义。Notch3与CD133的表达存在正相关关系，提示CRC的形成可能是由于Notch信号通路对CSCs的调控失调所致，进一步深入研究对阐明CRC的发生机制及靶向治疗具有重要意义。

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