miRNA-146a和Toll样受体2对幼鼠细菌性脑膜炎的影响

王艳萍，华 颖，徐晓华，王健彪

(江苏省无锡市儿童医院儿神经内科 214023)

细菌性脑膜炎是常见的中枢神经系统感染性疾病，其中常见病原菌为肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，SP)[1]。Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)是革兰阳性菌的天然模式识别受体，介导宿主对SP等革兰阳性菌的免疫炎性反应[2]。微小RNA146a(miRNA-146a)是第1个被发现于免疫系统中的具有调节作用的miRNA[3]，其下游基因参与炎症免疫的发生与发展。研究表明miRNA-146a参与了细菌性脑膜炎的发病机制[4]，很有可能成为治疗细菌性脑膜炎的最新靶点。本实验以SP性脑膜炎为模型，探讨miRNA-146a、TLR2及其信号通路在细菌性脑膜炎免疫病理机制中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级健康雄性3周龄C57BL/6小鼠24只，南京医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(苏)2015-0005]，饲养于实验动物中心，室温(22±2)℃，光照时间8:00～20:00，自由饮水进食。实验过程中对动物的处置遵照科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1.2方法

1.2.1SP混悬液和模型制备 将SPⅢ型菌株(31003-16，购自北京中国药品生物制品鉴定所),接种于血琼脂糖培养基，于37 ℃ 50 mL/L CO2环境中生长过夜后，接种于脑心浸液，置于37 ℃恒温摇床(250 r/min)孵育过夜，生长至对数生长中期收菌,用生理盐水冲洗离心(3 000 r/min)2次,再进行倍比稀释，制成细菌混悬液(1010/L)。采用侧脑室注射法制备脑膜炎小鼠模型[5]：水合氯醛0.15～0.20 mL/100 g体质量腹腔麻醉后，固定于立体定位仪(AP:-0.2～0.5 mm,L:1.0 mm,H:2.5～3.0 mm)。在充分麻醉动物后，按以上方法向侧脑室内注射滂安天蓝溶液30 μL，颈椎脱臼法处死动物后进行解剖，见蓝色扩散于颅底、小脑延髓池、双侧侧脑室、脊髓腔等结构为定位准确。

1.2.2实验分组与标本收集 小鼠分为3组：对照组、Pam3CSK4预处理组(Pam3CSK4购自美国InvivoGen公司)和模型组。对照组不进行任何干预，Pam3CSK4预处理组腹腔注射Pam3CSK4，每只100 μg。24 h后Pam3CSK4预处理组和模型组进行侧脑室注射细菌混悬液。标本收集：接种24 h后各组动物多聚甲醛麻醉后，采用眼球采血法收集血液标本，然后快速断头，在冰上取脑组织，立即放置液氮冷冻，随后移入-80 ℃冰箱保存备用。检测前将脑组织进行液氮研磨，匀浆，10 000 r/min离心20 min，取上清液备测。血清3 500 r/min 离心20 min后取上清液备测。

1.2.3酶联免疫吸附法(ELISA)法检测 采用ELISA法检测外周血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平，操作步骤按照试剂盒说明书，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2.4荧光实时定量PCR(QRT-PCR)检测 应用Trizol提取RNA，并采用紫外分光光度计测其吸光度(OD)值大于1.8。按试剂盒说明书操作进行反转录合成cDNA，随后进行QRT-PCR扩增。TLR2:上游5′-AAACTGTGTTCGTGCTTTCTGA-3′，下游5′-CTTTCTTCTCAATGGGTTCCAG-3′，扩增产物170 bp；髓样分化因子88(MyD88)：上游5′-ATAGGCAACCAGCAGAAACAG-3′,下游5′-TATCATTGGGGCAGTAGCAGA-3′，扩增产物181 bp，肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6)：上游5′-AGCCACAATCCCATG-3′,下游5′-GTCACGGAAAGGCGC-3′,扩增产物194 bp；核因子kappa(NF-κB)：上游5′-GATTTCGTTTCCGTTATGT-3′,下游5′-TTTGCTGGTCCCACATAG-3′，扩增产物125 bp；GAGAPDH:上游5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3′,下游5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3′，扩增产物167 bp。miRNA-146a上游引物序列为：5′-GCTGAGAACTGAATTCCATGGGT-3′，下游引物为试剂盒提供的通用引物，扩增产物76 bp，内参为U6，由试剂盒一起提供；引物设计与合成由上海生物工程公司完成。实验数据采用2-△△CT法进行分析。

2 结 果

2.1各组血清TNF-α、IL-6和MCP-1水平变化 与对照组比较，在注射SP 24 h后模型组小鼠血TNF-α、IL-6和MCP-1水平明显增高(P<0.01)；与模型组比较，Pam3CSK4预处理组TNF-α、IL-6和MCP-1明显下降(P<0.01)，见表1。

表1 各组TNF-α、IL-6和MCP-1水平变化

表2 各组TLR2、MyD88、TRAF-6、NK-κB和miRNA-146a mRNA表达比较

2.2脑组织TLR2、MyD88、TRAF-6、NK-κB和miRNA-146a mRNA表达 与对照组比较，在注射SP 24 h后模型组小鼠脑组织的TLR2、MyD88、TRAF-6、NK-κB和miRNA-146a mRNA表达明显增高(P<0.01)，与模型组比较，则Pam3CSK4预处理组脑组织的TLR2、MyD88、TRAF-6、NK-κB和miRNA-146a mRNA表达水平明显下降(P<0.01)，见表2。

3 讨 论

细菌性脑膜炎是儿童中常见的中枢神经系统急性感染病，幸存患儿常出现神经系统后遗症，包括认知障碍、听力丧失、视力受损和脑积水等，早期诊断和治疗，减轻脑膜炎性反应，对于改善预后具有重要意义[6]。SP是细菌性脑膜炎的常见致病菌之一，本研究发现，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6和MCP-1水平明显增高，脑组织的TLR2、MyD88、TRAF-6、NK-κB mRNA表达也明显增多，采用TLR2受体拮抗剂Pam3CSK4预处理后，Pam3CSK4预处理组各项指标明显下降，提示TLR2受体及信号通路在细菌性脑膜炎的病理机制中发挥关键作用。Pam3CSK4预处理后，miRNA-146a的mRNA表达水平也明显下调，提示miRNA-146a参与TLR2受体及信号通路的调节。

TLRs是天然免疫应答的病原分子识别受体[7]，能够识别病原体，介导信号传导途径，启动机体的天然免疫反应，诱导宿主防御功能相关功能活化，包括促炎性细胞因子，抗炎性细胞因子等，从而清除病原微生物。其中TLR2是TLRs中分布最广泛的受体[8-9]，广泛分布于机体免疫系统的防御第一线，在肺部、心脏、大脑等组织中均有表达，具有广泛的致病微生物识别谱，可识别革兰阳性菌、革兰阴性菌、螺旋菌、霉菌、真菌，甚至能识别原生动物和病毒。有学者研究结果表明，TLRs在儿童感染性、脑膜炎的免疫反应中具有重要意义[10-11]，TLR2可随着CRP水平增加而升高，有望成为儿童感染性疾病的诊断指标之一。

TLR2分为胞内域、跨膜域和胞外域，其中胞外域包含亮氨酸富集重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)，主要用于识别PAMPs；胞内域为Toll/IL-1受体(Toll/IL-1 receptor，TIR)结构域，主要用来激活下游信号通路。MyD88是TLR2信号通路的关键分子[12]，MyD88与TIR结构形成蛋白复合体后，其死亡结构域募集下游的IL-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK)、TRAF-6等信号分子，促使NK-κB活化，激活NF-κB转录依赖途径，继而促进多种促炎性分子基因的转录，如TNF-α、IL-6和MCP-1等，通过炎性反应清除病原体感染，从而提高患儿生存率，减少不良反应。

miRNA-146a是一种与炎症密切相关的miRNA，在T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等多种免疫和炎症细胞中高表达。研究表明，miRNA-146a基因的启动子序列中含有多个NF-κB结合位点[13]。IL-1和TNF-α等多种免疫和炎症相关因子可以通过NF-κB依赖的方式促进miRNA-146a的表达，但是相关的结合位点及结合时间点仍不清楚，有待进一步研究。TRAFs和IRAK是TLRs的下游调节因子，在介导细胞因子和TLR受体诱导的NF-κB活化和炎症过程中发挥重要作用，而TRAF6和IRAK1均为miRNA-146a的靶基因[14]，研究表明，过表达miRNA-146a可下调二者的蛋白表达，从而降低NF-κB的活性，因此，miRNA-146a可通过调控TRAF6和IRAK1，作用于TLR及其NF-κB信号通路，形成负反馈调节环路，调控炎症与免疫反应。miRNA-146a和Toll样受体2信号通路的研究工作为儿童化脓性脑膜炎的诊断和治疗提供了新思路，目前miRNA-146a在儿童化脓性脑膜炎的临床研究少见报道，仍需进一步完善相关研究以指导临床工作。

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