肝脂溶颗粒对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织PPARα表达的影响※

隋晓丹

（长春中医药大学附属医院肝脾胃病科，吉林 长春 130021）

本实验通过观察肝脂溶颗粒对非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型大鼠肝脏组织PPARα表达的影响，及肝脏组织PPARα表达在NAFLD中的作用并探明调节其作用的传导途径，为中医临床干预治疗非酒精性脂肪肝提供理论依据和新的思路。

1 实验材料

1.1 实验动物 Wistar大鼠60只，雄性，体重（200±20）g。

1.2 药物 肝脂溶颗粒：长春中医学院附属医院制剂室，批准文号：长卫制药字 (96)1367号。

多烯磷脂酰胆碱胶囊：赛诺非安万特（北京）制药有限公司，批准文号：国药准字H20059010。

2 实验方法

2.1 非酒精性脂肪肝模型复制方法 大鼠适应环境1周后随机分为正常组9只、高脂组51只。正常组予普通饲料喂养，高脂组予高脂饲料（88%基础饲料、10%猪油、2%胆固醇）喂养，自由饮水。12周后随机选出7只大鼠（正常组1只，高脂组6只），处死后取肝脏组织进行HE染色，验证造模情况。

2.2 实验动物分组及给药方法 12周后，正常组大鼠普通饲料喂养同时每日生理盐水灌胃。高脂组大鼠随机分为模型组、多烯磷脂酰胆碱胶囊对照组（简称：对照组）、肝脂溶颗粒高、中、低剂量组（简称：高、中、低剂量组）。继续高脂饲料喂养同时每日给予不同药物进行灌胃（模型组：生理盐水灌胃1 mL/100 g；对照组：多烯磷脂酰胆碱胶囊水溶液灌胃，按0.14 g/kg体重给药；高剂量组：100%浓度肝脂溶颗粒水溶液灌胃，按3 g/kg体重给药；中剂量组：70%浓度肝脂溶颗粒水溶液灌胃，按2.1 g/kg体重给药；低剂量组：30%浓度肝脂溶颗粒水溶液灌胃，按0.9 g/kg体重给药）。连续灌胃4周后取材。

2.3 肝脏组织标本采集 腹主动脉取血处死大鼠，打开腹腔完整分离肝脏，快速取下肝脏组织放入预先消毒的冻存管中，立即置于液氮中，保存待用。

2.4 观察指标 RT-PCR法测定肝脏组织PPARα的表达。

2.4.1 Trizol法提取组织总RNA

2.4.2 RNA纯度的测定 采用Trizol RNA法提取肝脏组织总RNA后，利用紫外分光光度计测260 nm、280 nm的紫外吸收值，计测OD260/280值，1.9～2.1为较纯的RNA。

2.4.3 逆转录反应

2.4.4 荧光PCR反应 引物合成：PCR扩增引物由上海生物工程有限公司设计合成。见表1。

表1 引物设计

2.4.5 PCR产物的检测和分析 取5 μLPCR产物进行2%琼脂凝胶5 V/cm电泳，电泳结果用凝胶紫外扫描成像仪扫描，用Bandscan软件进行图像分析，测定各电泳带灰度值，计算PPARα mRNA的RT-PCR产物与GAPDH mRNA的灰度比值 (V值)，作为PPARα mRNA的表达值。

PPARα mRNA相对表达量=PPARα电泳带灰度值/GAPDH电泳带灰度值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件处理数据，计量资料数据以均数加减标准差±s）表示。

3 实验结果

半定量RT-PCR检测大鼠肝脏PPARα mRNA水平的变化，检测结果显示：从肝组织PPARα相对表达量(v值)来看，正常组明显高于其它各组 (P＜0.01)，差异有统计学意义；模型组明显低于其它各组 (P＜0.01)，差异有统计学意义；高剂量组最接近正常组，显著高于其它药物干预组 (P＜0.05)，差异有统计学意义；中剂量组与对照组相比 (P＞0.05)，差异有统计学意义；低剂量组低于高、中剂量组及对照组 (P＜0.05)，差异有统计学意义。说明肝脂溶颗粒有提高肝脏组织PPARα基因表达的作用。见表2。

表2 各组大鼠16周末肝脏组织PPARα mRNA水平比较(v值)±s）

表2 各组大鼠16周末肝脏组织PPARα mRNA水平比较(v值)±s）

注：与正常组相比 *P＜0.01，**P＜0.05；与模型组相比 △P＜0.01，△△P＜0.05；与对照组相比#P＜0.05，##P＞0.05

组别 只数 PPARa mRNA正常组模型组对照组高剂量组中剂量组低剂量组8 9 8 9 8 9 2.64±0.35 0.59±0.42*1.83±0.28*△2.18±0.67*△#1.77±0.53*△##0.92±0.16*△#

图1 PCR电泳图

4 讨论

过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARs)是一种较新的甾体激素类核转录因子，根据其结构及功能可分为α、β和γ三种亚型，PPARs[1]可以调节细胞脂肪酸代谢的各个环节，而参与脂肪酸氧化系统的一些关键酶均由PPARα调节，PPAR-α在脂质代谢中占有重要地位——维持体内脂质代谢的动态平衡。PPARα在肝细胞内含量较丰富，能够通过多种途径来保持肝细胞内的脂质内环境稳定[2]，如：调节脂蛋白的代谢，而促进肝脏对脂肪酸的摄取、转运及氧化利用；抑制游离脂肪酸和三酰甘油的合成等。PPARα的激活还能够通过降低体重，降低TG和FFA水平，减少机体脂肪含量及降低某些参与IR的细胞因子合成，如IL-6，TNF-a，补体C3等，从而提高全身的胰岛素敏感性[3]，改善IR。PPARα功能缺陷可引起能量代谢紊乱、肝脏微血管周围脂肪沉积、炎症导致脂肪性肝炎[4]。因此，如PPARα缺失就会导致脂肪酸氧化减少或胰岛素抵抗而导致NAFLD。

刘铁军教授总结多年治疗非酒精性脂肪肝的临床经验，认为肥甘是非酒精性脂肪肝的重要病因，其形成与湿、热、瘀、积有关。治疗上，遵循《素问·至真要论》所谓“坚者消之”“结者散之”“逸者行之”“衰者补之”的法则，根据病机施以清热利湿、化瘀消积之法。自研肝脂溶颗粒，由决明子、泽泻、茯苓等组成。本实验结果可见肝脂溶颗粒能增强肝脏组织PPARα mRNA表达，能在基因水平上影响肝脏脂质的合成，调节脂质代谢，促进脂肪酸氧化分解，减轻肝细胞脂质沉积，达到治疗NAFLD的作用。其疗效与剂量呈正相关，且增强PPARα mRNA表达水平的效果优于多烯磷脂酰胆碱胶囊。

高脂饮食诱导致NAFLD大鼠肝脏组织PPARα表达明显减弱，这可能是大鼠引起非酒精性脂肪肝的机制之一，肝脂溶颗粒明显增强了肝脏组织PPARαmRNA表达，因此，肝脂溶颗粒对非酒精性脂肪肝的防治作用，可能是通过增强肝脏组织PPARα mRNA表达，在基因水平上影响肝脏脂质的合成而实现的。

[1]FERRE P.The biology of peroxisome prolif erators-activated receptors:relationship with lipid metabolismand insulin sensitivity[J].Diabetes，2004（53）:43-50.

[2]EVERETTL，GALII A，CRABBD.The role ofhepatic peroxisome proliferatoractivatedreceptors(PPARs)inhealthanddisease[J].Liver，2000（20）:191-199.

[3]Rurh M，Peter HJ.The metabolic syndrome and type 2 diabetes:role of the adipocyte[J].Curr Opin Lipidol，2003，14:549-553.

[4]Rao MS，Reddy JK.Peroxisomal beta-oxidation and steatohepatitis[J].Semin Liver Dis，2001，21(1):43-55.