番茄遗传转化与筛选鉴定的改进研究

祁春芳，王 婷，刘霞宇，石晓雯，于治芹，刘世芳，梁建萍，贾小云

(1. 山西省桑干河杨树丰产林实验局，山西大同 037006; 2. 山西农业大学 生命科学学院，山西太谷 030801)

番茄(Lycopersiconesculentum)是世界上最重要的果蔬作物之一[1]，具有基因组数目较小(950 Mb)、自花授粉、产量高、生长期短等特点，是生产转基因产品的模式植物之一[2-3]。番茄转基因技术经过30多年的研究，尤其是番茄全基因组测序的完成[4]，加快高产和高营养番茄品种的培育，目前已获得抗寒性强[5]、抗病虫害[1]、耐贮藏、口感好和高花青素含量[6]的番茄，为田间生产提供一些新的优势种。

植物遗传转化是指用离体培养的植物组织、细胞或原生质体作为受体，通过遗传转化方法向受体内转入外源基因，获得稳定表达的转基因植物体[7]。常用植物遗传转化方法有基因枪法、电击法、显微镜注射法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。在番茄中，农杆菌介导的遗传转化法应用较广泛[8-9]，但转化率不稳定和转化效率低是番茄遗传工程改良的主要问题。影响番茄遗传转化率的因素包括：外植体、农杆菌类型、外源基因的选择、菌液OD值、侵染、预培养和共培养时间等。已有的番茄转化相关研究表明，当外植体为子叶[10-15]、菌株为GV3101[16]、OD600值为0.2～0.6、农杆菌侵染时间为5～20 min[8,11]、预培养时间为2 d[11-12]、共培养时间为48～72 h时转化率较高[8,11]。

为方便筛选和鉴定转基因植株，大多数用于遗传转化的载体中通常含有选择标记基因。新霉素磷酸转移酶基因 nptⅡ可使卡那霉素(Kan)发生磷酸化而失活，进而导致植物产生卡那霉素抗性。pC2300-pOT2植物表达载体中含有Kan抗性基因，因此含此载体的转基因植株在含Kan的环境中能够继续生长，而非转基因植株则不能存活[17]。虽在小麦、棉花、大豆、水稻、玉米中已使用Kan研究过作物转基因后代的筛选，但是不同物种、同一物种的不同品种、甚至不同外植体对卡那霉素的抗性都不同，因而有必要对筛选转基因植株所用的卡那霉素浓度进行研究，以建立筛选转基因番茄Kan抗性株系的有效方法。

花青素是一种水溶性的天然色素，具有抵御疾病、抗炎症和改善视力等作用。黑莓、蓝莓和枸杞等浆果中含有较高的花青素，但此类浆果生产季节性强且不耐贮藏。因此通过植物遗传转化法，对常食用果蔬作物中某些与花青素合成、调控相关基因进行过表达或降低表达，能够提高花青素的含量。微小(RNA MicroRNA,miRNA)是一类内源性的单链非编码小分子RNA。研究发现miR828能够负调控蔗糖诱导下拟南芥中花青素的合成。本试验前期已经从模式植物拟南芥中分离到 pri-miR828基因，并构建 miR828过表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828[18-21]。本研究将以此载体的番茄转化为例，从番茄种子消毒处理方法、无菌苗培养方法、转基因阳性植株Kan筛选浓度、方式和PCR检测等方法来对番茄的遗传转化过程进行研究，旨在探索一套快速高效的番茄遗传转化和鉴定方法，为通过转基因技术改良番茄新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

野生型番茄种子‘Ailsa Craig’和农杆菌GV3101为山西农业大学生命科学学院贾小云教授课题组保存。番茄遗传转化重组载体pC2300-pOT2-pri-miR828由该课题组前期构建，载体携带CaMV35S启动子和 nptⅡ植物选择标记基因。

Marker DL1000、TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，PCR引物和其他药品试剂由生工生物工程(上海)有限公司合成或购买该公司BBI系列产品。

1.2 方 法

1.2.1 番茄种子的消毒和无菌苗的培养 取适量番茄种子于50 mL离心管中，用φ=75% C2H5OH浸种5 min，无菌水冲洗1次；饱和Na3PO3浸泡20 min(每2 min振荡1次)，无菌水冲洗3次；φ=1% NaClO水溶液浸泡10 min，无菌水冲洗4～6次，至纯净无泡沫。将消毒处理后的种子放入装有约25 mL无菌水的50 mL离心管中，置于恒温振荡摇床于180 r·min-1、25 ℃黑暗下震荡培养7 d，每天更换1次无菌水。

震荡培养结束后将种子播种于MS培养基上(培养基组分详见表1)，置于人工气候培养箱(1 800 lx、26 ℃、16 h光照/8 h黑暗)培养7 d。

1.2.2 番茄遗传转化 预培养：切取8～10 d苗龄的番茄子叶，去除尖端，放入盛有M17的培养皿中浸泡12 h后置于M1预培养基中培养2 d。

摇菌：将500 μL含 miR828过表达载体的农杆菌接种到装有5 mL液体LB培养基的50 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1条件下震荡培养12 h；然后于4 200 r·min-1下低温离心5 min，将沉淀用等体积的APM培养基重悬，再次于4 200 r·min-1下离心5 min；最后用约50 mL 液体MS培养基重悬振荡培养至OD600值为 0.2～0.3。

侵染与共培养：将预培养的子叶放入上述用MS重悬的农杆菌中培养15 min，然后用M17冲洗残留农杆菌，滤纸吸去多余的菌液，侵染后的子叶放入铺有新滤纸的预培养基M1上，弱光下共培养2 d。

选择培养：子叶转移到M13筛选培养基中，弱光培养7 d后更换培养基为正常光照培养，2周更换新的M13培养基。

芽诱导及伸长培养：待外植体长成直径1～2 cm 愈伤组织时，切去死去的部位，用灭菌滤纸吸干其上的水份，转移到M4中，使愈伤继续生长变大、长芽。

根诱导培养：待长成3～5 cm的小苗时，从芽与愈伤接触的最底部切下插入M16培养基上诱导生根。

移苗：番茄苗长至8 cm时(基本与组培瓶口相平)，将整棵植株移植到放置于温室中的花盆内，上面铺塑料膜，在幼苗恢复期逐渐揭开塑料膜，待继续生长到10～15 cm后从温室移植到大田中直至开花结果收获种子。

1.2.3 转基因番茄Kan最适质量浓度的筛选 向直径90 mm的培养皿中平铺2层滤纸，加入约15 mL 质量浓度分别为0、50、75、100 mg·L-1的Kan溶液，每皿中摆放20粒已消毒的野生型番茄种子，培养5～7 d后比较种子发芽和生长情况，确定转基因番茄的最适Kan筛选质量浓度。每个质量浓度设置2组重复。

1.2.4 转基因番茄Kan抗性筛选方式的确定 土壤浇灌Kan溶液筛选法：将经震荡培养后的野生型番茄种子种植到土壤中，待种子露白并长出1～2片子叶时分别浇灌无菌水和100 mg·L-1的Kan溶液，培养6～8 d观察幼苗的伸长情况。每处理35株幼苗。

MS培养基中添加Kan筛选法： 取已消毒的野生型和转基因番茄种子分别播种于含Kan质量浓度为100 mg·L-1和不含Kan的MS培养基上，培养10 d后观察种子在培养基的发芽生长情况。

蛭石浇灌Kan溶液筛选法：取2个直径120 mm培养皿，蒸馏水冲洗后表面铺一层蛭石，分别用无菌水和100 mg·L-1的Kan溶液将蛭石润湿，然后将震荡培养后的野生型和转基因番茄种子分别种植于蛭石中，观察、记录种子的变化情况。

表1 番茄遗传转化培养基配方Table 1 The media of tomato genetic transformation

注Note:R3V(R3 vitamins):1 g·L-1VB1,0.5 g·L-1VB3,0.5 g·L-1VB6.

1.2.5 PCR鉴定法 参照 CTAB 法从幼嫩的番茄叶片中提取 DNA[22]。然后以番茄叶片基因组DNA为模板，野生番茄为阴性对照，pC2300-pOT2-pri-miR828载体为阳性对照，分别扩增 At-pri-miR828目的基因，进行阳性转基因植株的鉴定。

根据载体上 At-pri-miR828序列设计1对能扩增出182 bp的特异引物mir828-PF:5′-TCATCATCTCTCTTACTCTCATGGTG-3′和mir828- PR:5′-TCCCACTTCCAAACATTGCT-3′。反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 34个循环； 72 ℃ 终延伸10 min。 PCR反应体系(20 μL)：模板2.0 μL，10× Buffer 2 μL,2.5 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL,10 μmol·L-1正反向引物各0.8 μL，5 μmol·L-1TaqE 0.4 μL，ddH2O 13.6 μL。PCR产物用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 种子消毒处理对发芽率的影响

种子消毒采用C2H5OH、Na3PO3及NaClO分别浸泡及无菌水反复冲洗的方法，能使污染率减少到5%以下。

2.2 震荡培养对番茄种子发芽和生长的影响

野生型番茄种子的发芽结果见图1。图1-A显示直接将经过消毒的种子接于培养基15 d后发芽率仅为约50%且生长势不一致。图1-B为消毒的种子经7 d震荡培养露白后再接种于培养基继续培养7 d后的生长情况。全部种子基本都发芽且生长势一致。

图1 震荡培养对番茄种子发芽和生长的影响Fig.1 Effect of shock culturing on germination and growth of tomato seeds

2.3 番茄的遗传转化

番茄遗传转化过程如图2所示。用OD600值为0.2～0.3的农杆菌侵染番茄幼苗子叶15 min，然后置于含有滤纸的M1预培养基上2 d(图2-A)，再置于M13选择培养基上待愈伤组织逐渐分化并增大(图2-B和2-C)。

当愈伤组织长至1～2 cm时，切割丛生芽并转移到M4芽诱导培养基。当丛生芽长至3～5 cm时(图2-D)转移到根诱导培养基中，使植株长出茂盛的丛生根(图2-E)。当植株继续长至10 cm 左右时(图2-F)，打开瓶口炼苗生长3～5 d，然后将植株移植到装有营养土的花盆中。移植后先用透明的塑料膜盖住上部以保持湿度，再循序渐进地揭开膜，待番茄幼苗健壮成活后转移到大田中，开花结果后收获果实，获得种子(图2-G、2-H、2-I)。本试验共转化子叶200个，获得65个Kan抗性株系，转化效率为32.5%。

A.共培养 Co-culture；B.选择再生 Selective regeneration；C.抗性愈伤分化 Resistance callus differentiation；D.抗性芽生长 Resistance shoot growth；E.根生长 Root growth；F.炼苗生长 Seedling growth；G.花盆移栽 Flowerpot transplanting；H.温室培养 Greenhouse culture；I.田间收获 Field harvesting

图2番茄遗传转化过程
Fig.2Genetictransformationoftomato

2.4 转基因番茄Kan耐受最适质量浓度的筛选

由图3可见，无菌水处理的野生型番茄种子作为对照(0 mg·L-1Kan)，其种子能够萌发、健壮生长、根系繁茂。经不同质量浓度 Kan 处理后，野生型番茄种子萌发均受到一定程度的抑制，随着Kan质量浓度的增加，生长缓慢、根系疏短、抑制作用逐渐加强。当Kan质量浓度为100 mg·L-1时，抑制作用较强，仅有不到30%的种子有萌发迹象，其余几乎不萌发，而且全部种子不能分化出根。后续试验证明，进一步增加Kan质量浓度不仅影响野生型番茄种子的萌发，具有Kan抗性基因的转基因种子的萌发也会受到抑制。因此，本试验得出筛选转基因番茄种子的最佳Kan质量浓度为100 mg·L-1。

2.5 Kan溶液浇灌土壤筛选法

如图4所示，种植于土壤中的野生型番茄幼苗分别用无菌水(A)和100 mg·L-1Kan溶液(B)浇灌后，虽然经Kan溶液浇灌后的幼苗生长较缓慢而且部分有点黄化，但是幼苗的整体生长情况和野生型差异不大，不太容易辨认，说明如果用100 mg·L-1Kan溶液浇灌土培番茄幼苗来筛选转基因植株可能会增加假阳性单株的数量，影响选择效果。

A.无菌水浇灌 Sterile water irrigation；B.100 mg·L-1的Kan浇灌 100 mg·L-1 Kan solution irrigation

2.6 MS培养基中添加Kan筛选法

如图5所示：野生型种子在MS培养基中正常萌发，生长健壮(5-A)，但在含Kan质量浓度为100 mg·L-1的培养基中基本不萌发生长(5-B)，而转基因番茄种子在含有Kan的培养基中仍生长健壮且生长势一致，根系发达(5-C)。因此，在培养基中添加质量浓度为100 mg·L-1Kan的方法可用来筛选转基因番茄种子。

2.7 Kan溶液浇灌蛭石筛选法

如图6所示：种植于用无菌水浇灌的蛭石中的野生型番茄种子7 d后可正常萌发、生长健壮，而用100 mg·L-1Kan溶液浇灌后的蛭石中的野生型番茄种子不萌发，但转基因番茄种子仍可萌发并长势整齐，说明用100 mg·L-1Kan浇灌蛭石培养番茄种子的方法可以用来筛选转基因番茄种子。

A. 野生型番茄MS培养基 Wild-type tomato on MS medium；B. 野生型番茄含Kan培养基 Wild-type tomato MS medium with Kan；C. 转基因番茄含Kan培养基 Transgenic tomato on MS medium with Kan

图5含Kan培养基筛选转基因番茄种子
Fig.5ScreeningoftransgenictomatobyMSmediumwithKan

A. 野生型番茄无菌水浸泡 Wild-type tomato sterile water soaking；B. 野生型番茄Kan浸泡 Wild-type tomato with Kan soaking；C. 转基因番茄Kan浸泡 Transgenic tomato with Kan soaking

图6Kan浇灌蛭石法筛选转基因番茄种子
Fig.6ScreeningoftransgenictomatobyseedsoakingwithKan

2.8 转基因番茄PCR鉴定法

选取12株经100 mg·L-1Kan筛选的抗性转基因番茄植株的叶片提取DNA，分别标为miR828-1、miR828-2、miR828-3、miR828-4、miR828-5、miR828-6、miR828-7、miR828-8、miR828-9、miR828-10、miR828-11和miR828-12。

以野生型番茄植株DNA为阴性对照，以pC2300-pOT2-pri-miR828载体质粒 DNA为阳性对照，分别进行 At-pri-miR828 PCR扩增。如图7 所示，所检测的12株番茄植株中除miR828-7、miR828-11以外，其余7株都扩增出与阳性对照大小相同的约182 bp的清晰条带，表明目的基因 At-pri-miR828已经成功整合到番茄基因组中。

M.Marker DL 1000; WT.野生型番茄 Wild type tomato；V.载体pC2300-pOT2-pri-miR828 pC2300-pOT2-pri-miR828 plasmid; 1～12.转基因番茄miR828-1～miR828-12 Transgenic tomatoes miR828-1-miR828-12

图7转基因番茄的PCR检测
Fig.7ThePCRidentificationoftransgenictomatoes

3 结论与讨论

植物外植体消毒效率的提高是遗传转化的基础。本研究先用φ=75% C2H5OH浸泡5 min，然后再用饱和Na3PO3浸泡20 min，最后用φ=1% NaClO水溶液浸泡10 min后能够使番茄种子的污染率控制在5%以下，达到很好的消毒效果。并且饱和Na3PO3能够杀灭深层霉菌和病毒，与强消毒效果的HgCl2相比，对环境和种子都没有伤害。震荡培养番茄种子露白后再接种于培养基可以使种子发芽后生长势一致，从而缩短转基因无菌苗的获得时间。

不同目标基因番茄的转化效率不同。本试验中，用含有 pri-miR828过表达载体的农杆菌共侵染番茄幼苗子叶，当预培养时间为2 d、菌液浓度为OD600=0.2～0.3和侵染时间为15 min时转化效率较高。本试验转化共使用200个子叶进行研究，最终统计获得65个转基因株系，转化效率为32.5%。在含有抗生素的M13培养基中，转基因后的子叶愈伤组织饱满，芽点嫩绿生长出很多丛生芽并正常分化(图2-B和2-C)。在含1.0 mg·L-1IAA的M16培养基中丛生芽生根效果好，最短5 d可生根，但不同个体的生根数量、时间及粗细存在差异。另外，子叶在选择培养基中容易向上卷曲，使部分子叶因营养缺乏而死亡，或者子叶的上翘可能使部分非转化细胞逃过抗生素的筛选而产生假阳性植株，所以要将子叶斜插入培养基中。在转换培养基时，注意要将外植体携带的原有培养基和水珠用滤纸吸干净，以防杂菌污染。

Kan是转基因筛选中常用的抗生素。本研究以番茄‘Ailsa Craig’为研究材料发现，当 Kan质量浓度为100 mg·L-1时，几乎全部种子不能正常生长和分化出根，说明100 mg·L-1是遗传转化时筛选抗性转基因番茄的最佳Kan质量浓度，与曹慧颖等[17]的研究结果相似。

除了在组织培养过程中向培养基中添加Kan可以筛选转基因植株外，通过Kan溶液浇灌蛭石、土壤等方法也可以对转基因后代进行筛选。本研究发现：用质量浓度为100 mg·L-1的Kan溶液浇灌蛭石和在MS培养基中添加Kan的方法都可以用来筛选转基因番茄，但用100 mg·L-1Kan溶液浇灌土培番茄幼苗时筛选效果不理想。100 mg·L-1Kan溶液浇灌土壤后，番茄幼苗的整体生长情况和野生型差异不大，不太容易辨认，影响选择效果。

PCR鉴定法是检测外源基因是否插入植物基因组的直观有效的手段。本研究对经100 mg·L-1Kan筛选的12株抗性转基因番茄植株进行外源基因 At-pri-miR828的PCR检测发现，10株可检测到目的基因。由此也表明，利用100 mg·L-1Kan溶液浇灌蛭石和在MS培养基中添加Kan的方法可快速、准确地筛选转基因番茄植株。

本研究在组织培养的过程中也出现畸形芽、盲芽问题。有的只是长出一片或多片肥厚的叶片、甚至是丛生杂乱的叶片而没有生长点，有的虽有顶芽，但顶芽矮壮且肥厚，叶片较顶芽大且卷曲。这些畸形芽和盲芽都不能长成健康的植株，具体原因还在研究中。

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