响应面试验优化链霉菌Z331-A的发酵条件

范丽霞,胡晓苹,刘文波,RAJAOFERA Mamy Jayne Nelly,唐中发,缪卫国*

(1.海南大学 食品学院,海南 海口 570228；2.海南大学 热带农林学院,海南 海口 570228)

链霉菌属(Streptomyces sp.)是放线菌的一个大属,其所产生的活性物质约占所有放线菌所产生物活性物质的2/3以上［1］。其中,链霉菌属所产抗生素的产量约占微生物所产抗生素总量的70%［2］。目前,从海洋链霉菌中不断有新颖的具有生物活性的化合物分离出来［3-7］,正逐渐成为研究的热点。而且,由于链霉菌所产抗生素多是天然的、绿色药剂,具有抗性机制多样、对环境安全等特点而被广泛关注［8］。然而,微生物源抗生素的产量低也依然是个问题,制约着抗生素的开发［9-10］。

实验室从海南热带海洋的盐碱土壤中分离出一株链霉菌Z331-A,具有广谱活性,且活性稳定,是一种极具经济价值和开发潜力的微生物。考虑到链霉菌代谢产物的产量受发酵条件影响较大［11］,极其影响后期活性产物的分离及其他的开发研究,所以链霉菌发酵工艺的建立尤为重要。响应面法是生物研究中优化培养基的重要方法,不仅能充分地反映试验中各因素和水平的效果,直观地分析各因素之间的交互作用,克服了正交试验设计只能处理离散的水平值的缺陷,还能找出试验中各因素的最佳组合并预测响应值的最优值［12-13］。

为提高链霉菌Z331-A中抑菌活性物质的产量和进一步开发该菌,本研究采用响应面法对其液体发酵培养条件进行优化,以期为进一步扩大培养、活性产物分离和应用等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株与试剂

链霉菌(Streptomyces)Z331-A：分离自海南近海盐碱性土壤,保存于海南大学食品学院微生物实验室；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC6633：广东省微生物菌种保藏中心。

麦芽提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、可溶性淀粉、无水葡萄糖、碳酸钙(均为生化试剂或分析纯)：广东环凯微生物科技有限公司；磷酸氢二钾(分析纯)：广州化学试剂厂；结晶硫酸镁、硝酸钾、硫酸亚铁、氯化钠(均为分析纯)：西陇化工股份有限公司；黄豆粉：山东朝旭食品有限公司。

1.1.2 培养基的配制

基础培养基(高氏一号液体培养基)：可溶性淀粉20 g,硝酸钾1 g,磷酸氢二钾0.5 g,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,水1 000 mL,pH值7.4～7.6。

发酵培养基：

①高氏一号液体培养基：同基础培养基。

②ISP-2液体培养基：酵母提取物4 g,葡萄糖4 g,麦芽提取物10 g,碳酸钙2 g,水1 000 mL,pH值7.4～7.6。

③黄豆粉液体培养基：黄豆粉40 g,蛋白胨2 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,pH自然。

④LB液体培养基：蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,蒸馏水1 000 mL,pH7.0。

⑤马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)培养基：葡萄糖20 g,马铃薯200 g,水1 000 mL,自然pH值。

⑥酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose,YEPD)培养基：葡萄糖20 g,胰蛋白胨20 g,酵母粉10 g,自来水1 000 mL,pH自然。

1.2 仪器与设备

HMS-310振荡培养箱：天津恒奥科技发展有限公司；SW-CJ-2FD双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；BCD-245D美菱冰箱：合肥美菱股份有限公司；CL-321型台式高压灭菌锅：日本ALP公司；SPX-250智能生化培养箱：宁波海曙赛福实验仪器厂；UV-1800紫外可见分光光度计：岛津(中国)有限公司；BM340超低温冰箱：法国Froilabo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及发酵方法

取冷冻于甘油管的菌株Z331-A,按1%的接种量接种于装液量为40 mL/100 mL的高氏一号液体培养基中,28℃、180 r/min摇瓶培养2～3 d后得到一级种子液。按3%的接种量接种到装液量为40 mL/100 mL的高氏一号液体培养基中,28℃、180 r/min摇瓶培养2～3 d后得到二级种子液,再按3%的接种量接种到装液量为40 mL/100 mL的发酵培养基中,28℃、180 r/min摇瓶培养7 d,得发酵产物。

1.3.2 发酵培养基的筛选

将种子培养基以3%接种量接入6种常用的放线菌培养基中(高氏一号、黄豆粉、PDB、LB、YEPD、ISP-2液体培养基),28℃、180 r/min培养7 d,测定在不同培养基中发酵液对测试菌枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径大小,确定最佳发酵培养基,进行3次重复。

1.3.3 抑菌活性物质测定

菌株Z331-A经过菌种活化后发酵,发酵条件为：28℃,装液量为40 mL/100 mL,180 r/min,培养7 d得发酵产物后,9 000 r/min离心、去沉淀,即获得发酵上清液,0.22μm的滤膜过滤,即为待测无菌发酵液。

本试验以枯草芽孢杆菌为测试菌,采用纸片扩散法,每个纸片含相应的发酵液25μL,阳性对照为黄胺药敏纸片(300μg/片),以十字交叉法测定待测无菌发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小,每组3个重复。

1.3.4 单因素试验

在其他发酵培养条件一致的情况下,研究发酵时间(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d、13 d、14 d、15 d)、装液量(10 mL/100 mL、20 mL/100 mL、30 mL/100 mL、40 mL/100 mL、50 mL/100 mL)、接种量(2%、4%、6%、8%、10%)、培养温度(20℃、24℃、28℃、32℃、36℃)、摇瓶转速(160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min)对链霉菌Z331-A发酵液抑菌圈直径大小的影响。

1.3.5 Plackett-Burman设计确定关键影响因素

根据单因素试验结果,采用Plackett-Burman(PB)试验设计以影响菌株培养条件的发酵时间、装液量、接种量、摇瓶转速、培养温度5个因素为自变量,发酵液抑菌圈直径(Y)为响应值,确定各因素的高(1)低(-1)水平值,进行PB试验设计。PB试验设计因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.6 中心组合试验设计

根据PB试验结果,确定发酵时间、接种量、摇瓶转速为主要考察因素,以单因素试验结果的最适条件作为中心水平,即0水平［14-15］,并以之为中心,利用响应面分析法的中心组合设计(central composite design,CCD)试验对链霉菌Z331-A发酵条件进行优化。

1.3.7 数据处理

采用最小显著差法(leastsignificantdifference,LSD)对结果进行显著差异分析。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的筛选

由图1可知,在高氏一号、黄豆粉、PDB、YEPD、LB、ISP-2这6种液体培养基中,菌株Z331-A在ISP-2培养基中发酵时对供试细菌(枯草芽孢杆菌)产生的抑菌圈直径最大,为17.11 mm,其次为高氏一号培养基(15.29 mm),YEPD培养基(13.13 mm),LB培养基(12.34 mm),黄豆粉培养基(11.2 mm),PDB培养基(9.5 mm),所以选用ISP-2培养基作为后续试验的发酵培养基。

图1 发酵培养基的筛选Fig.1 Screening of fermentation medium

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 发酵时间对发酵液抑菌活性的影响

考察发酵时间对抑菌圈直径的影响,结果见图2。由图2可知,随着发酵时间的延长,抑菌圈直径呈先增加后减小的趋势。发酵液的抑菌活性从第3天开始产生,当发酵时间为3～7 d时,发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径迅速增加；当发酵时间为7 d时,发酵液抑菌圈直径达到最大值,为20.85 mm。继续延长发酵时间,抑菌圈直径开始减小。这可能与底物消耗和有害物质的积累产生的负面影响有关［16］。因此,选择最佳发酵时间为7 d。

图2 发酵时间对抑菌圈直径的影响Fig.2 Effect of fermentation time on inhibition zone diameter

2.2.2 装液量对发酵液抑菌活性的影响

考察装液量对抑菌圈直径的影响,结果见图3。由图3可知,随着装液量的增加,抑菌圈直径呈先增加后减小的趋势。当装液量为10 mL/100 mL～30 mL/100 mL时,抑菌圈直径迅速增加；当装液量为30 mL/100 mL时,发酵液抑菌圈直径达到最大值,为20.4 mm。继续增加装液量,抑菌圈直径开始下降。这可能是由于通气量减少,菌株生长受到抑制,导致抑菌活性下降。因此,选择最佳装液量为30 mL/100 mL。

图3 装液量对抑菌圈直径的影响Fig.3 Effects of liquid volume on inhibition zone diameter

2.2.3 接种量对发酵液抑菌活性的影响

考察接种量对抑菌圈直径的影响,结果见图4。由图4可知,随着接种量的增加,抑菌圈直径呈先增加后减小的趋势。当接种量为2%～6%时,发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径迅速增加；当接种量为6%时,发酵液抑菌圈直径达到最大值,为20.01 mm。继续增加接种量,抑菌圈直径开始缓慢下降。原因可能是种子液浓度过低,会导致生长缓慢,而种子液浓度过高,会引起菌体过早进入衰亡期,从而发酵能力下降［17］。因此,选择最佳接种量为6%。

图4 接种量对抑菌圈直径的影响Fig.4 Effect of inoculum on inhibition zone diameter

2.2.4 摇瓶转速对发酵液抑菌活性的影响

图5 摇瓶转速对抑菌圈直径的影响Fig.5 Effect of shaker speed on inhibition zone diameter

考察摇瓶转速对抑菌圈直径的影响,结果见图5。由图5可知,随着摇瓶转速的增加,抑菌圈直径呈先增加后减小的趋势。当摇瓶转速为160～200 r/min时,发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径迅速增加；当摇瓶转速为200r/min时,发酵液抑菌圈直径达到最大值,为20.45 mm。继续增加摇瓶转速,抑菌圈直径开始下降。因此,选择最佳摇瓶转速为200 r/min。

2.2.5 培养温度对发酵液抑菌活性的影响

考察培养温度对抑菌圈直径的影响,结果见图6。由图6可知,随着培养温度的升高,抑菌圈直径呈先增加后减小的趋势。当培养温度为20～28℃时,发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径迅速增加；当培养温度为28℃时,发酵液抑菌圈直径达到最大值,为20.45 mm。继续升高培养温度,抑菌圈直径开始下降。因此,选择最佳培养温度为28℃。

图6 培养温度对抑菌圈直径的影响Fig.6 Effect of culture temperature on inhibition zone diameter

2.3 Plackett-Burman设计确定关键影响因素

在单因素试验的基础上,采用Design-Expert V 8.0.6软件设计PB试验各因素与水平,PB试验设计及结果如表2所示,每组设置3个平行重复。

表2 Plackett-Burman试验设计及结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

采用SAS9.0软件对表2的数据进行逐步回归分析,得到偏回归系数及显著性检验结果见表3。由表3可知,因素X1、X3、X4的P值分别为＜0.000 1、0.000 7、0.070 9,即因素X1、X3对响应值Y的影响极显著(P＞0.01),X4的P值＞0.05,但SAS 9.0软件显示各因素P值＜0.150 0水平均是有意义的,故将因素X4考虑进去,作为响应值Y影响的第3个因素。因此选择影响抑菌圈直径的关键因素为发酵时间、培养转速和接种量。

表3 Plackett-Burman试验的偏回归系数及显著性检验Table 3 Partial regression coefficients and significance test of Plackett-Burman experiments

2.4 响应面设计与分析

在PB试验结果基础上,用Design-Expert V8.0.6软件,以抑菌圈直径(Y)为响应值,对发酵时间(A)、接种量(B)和摇瓶转速(C)这3个因素进行3因素3水平的中心组合试验设计,响应面试验设计与结果见表4,方差分析见表5。

表4 链霉菌Z331-A发酵条件优化响应面试验设计与结果Table 4 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of Streptomyces Z331-A

表5 响应面试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface experiments results

运用Design-Expert V 8.0.6软件对表4进行多元线性回归和二项式拟合,得到发酵液抑菌活性大小响应面模拟方程如下：

Y=24.08+0.7A+0.2B+0.26C-0.17AB-0.42AC-0.017BC-0.92A2-0.12B2-0.16C2

由表5可知,回归模型P=0.003 2＜0.01,说明模型达到差异极显著水平,实验设计可靠；模型相关系数R2为0.8580,表明其回归方程拟合良好。模型一次项A、二次项A2差异均极显著(P＜0.01),其他因素不显著,由表5P值可知,3个因素对抑菌圈直径影响大小依次为发酵时间＞摇瓶转速＞接种量。失拟项P值为0.367 3＞0.05,即方程模型失拟项差异不显著,表明该模型可信度高,能较好地反应各因素与响应值之间的关系。因此,利用该回归方程能够对实验结果进行拟合和预测分析。

由图7可以直观地观察出,发酵时间(A)、接种量(B)、摇瓶转速(C)这3个因素对抑菌圈直径(Y)的影响,影响越大坡度越陡。随着A的增加,Y呈现先增加再减少的趋势,表明发酵时间有最优值；在3个响应面图中其坡度最陡,表明发酵时间对抑菌圈直径的影响最显著,与表4方差分析结果相吻合。这3个因素之间交互作用的强弱可以通等高线形状直观地反映出来,交互作用越明显,则等高线的椭圆形越明显,反之就越圆。依据图7,这3个因素的交互作用为AC＞AB＞BC,与表5方差分析结果相符。

图7 发酵时间、接种量、摇瓶转速交互作用对抑菌圈直径影响的响应面及等高线Fig.7 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between fermentation time,inoculum and shaker speed on inhibition zone diameter

2.5 最优发酵条件预测及试验结果验证

运用Design-Expert软件对模型进行最优化预测,最大抑菌圈直径为24.29 mm,得到链霉菌Z331-A最佳发酵条件为发酵时间7.21 d,接种量5.65%,摇瓶转速210.18 r/min,在此发酵条件下,抑菌圈直径预测值为24.29 mm。

为了进一步验证模型预测的最佳发酵工艺条件的准确性,同时考虑到实际操作,将发酵条件修正为发酵时间7.2 d,接种量5.7%,摇瓶转速210 r/min。在此最佳发酵条件下,进行3次验证试验,得到抑菌圈直径为24.30 mm,与模型预测值相接近,而且相比优化前的抑菌圈直径19.20 mm提高了26.56%。表明响应面法优化链霉菌Z331-A发酵条件真实可靠,可以较大提高发酵液的抑菌活性。

3 结论

本研究从6种培养基中筛选获得ISP-2培养基所发酵的链霉菌Z331-A发酵液对枯草芽孢杆菌抑菌效果最佳。以抑菌圈直径为考察指标,在单因素试验的基础上,对链霉菌Z331-A的发酵条件进行响应面试验优化。结果表明,链霉菌Z331-A的最佳发酵条件为发酵时间7.2 d,接种量5.7%,培养转速210 r/min。在此最佳发酵条件下,抑菌圈直径为24.30 mm,与模型预测值(24.29 mm)接近,与未优化前(19.20 mm)相比,抑菌圈直径提高了26.56%。为后续对该菌的开发和研究提拱了很好基础。

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