血管紧张素转化酶抑制剂产生菌的筛选及发酵条件优化

马英辉,李利军*,卢美欢

(陕西省微生物研究所,陕西 西安 710043)

血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)是一种膜结合糖蛋白［1］,广泛存在于人体血液中。ACE是一种多功能酶,在肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)中,通过形成活性血管紧张素Ⅱ使血压升高［2］；在激肽释放酶-激肽系统(kallikrein kinin system,KKS)中,通过使缓激肽失活,从而引起高血压［3］。所以,抑制ACE的活性是减少或治疗高血压的重要途径。ACE抑制剂是具有抑制ACE抑制活性的多肽类物质,是一种含有3～10个氨基酸残基的小分子多肽类物质,分子质量在300～10 000 Da之间［4］,1979年,OSHIMA G等［5］通过细菌胶原酶将明胶酶解后,从酶解液中分离出6组ACE抑制活性较好的组分,这是最早从食源性蛋白中提取到的ACE抑制肽。而后,科研人员开始研究各种食源性ACE抑制肽,LIY等［6］利用筛选出的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)Z17菌株发酵牛乳,并采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离纯化出2种ACE抑制肽。程龙等［7］从31株来源于云南传统发酵食品的乳酸菌中筛选出了具有产高效ACE抑制剂植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YM-4-3,ACE抑制率达到 81.23%。WUQ 等［8］采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶水解蚕蛹蛋白,经分离纯化后得到ACE抑制活性最高的多肽,半抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)值为102.15μg/mL。随着分子生物学的发展,王志国［9］以牛蛙肌肉蛋白来源的ACE抑制肽为基础,构建大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,制备ACE抑制肽,并通过体外和体内检测证明重组ACE抑制肽具有较高活性。但国内对于以大豆蛋白为基质微生物发酵法制备ACE抑制剂的研究还处起步阶段。

本研究对实验室保藏的已经在酿造行业工业化应用的菌株进行ACE抑制活性的筛选,并采用单因素试验对所筛选的菌株进行ACE抑制剂发酵条件优化,以期为后续工业法生产ACE抑制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

米曲霉(Aspergillus oryzae)KL、米曲霉(Aspergillus oryzae)1、米曲霉(Aspergillusoryzae)2、米曲霉(Aspergillus oryzae)3、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)90、黑曲霉(Aspergillusniger)3324、毛霉(Mucor sp.)309均为实验室保存菌株。

1.1.2 培养基

斜面培养基(牛肉膏蛋白胨、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextroseagar,PDA)培养基)：实验室自制；液体筛选培养基：大豆分离蛋白1%,葡萄糖2%,氯化钠0.5%,定容至1000mL,pH自然；液体发酵培养基：大豆分离蛋白20%,葡萄糖2%,氯化钠0.5%,pH自然；浅盘固体培养基：大豆500 g,1∶1(g∶mL)加水浸泡24 h,121℃灭菌30 min,其余培养基在121℃灭菌20 min。

1.1.3 化学试剂

血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酸标准品(纯度98%)、马尿酰-组胺酰-亮氨酸(hippurly-histidyl-leucine,HHL)(纯度99%)：美国Sigma公司；L-亮氨酸、牛血清蛋白、考马斯亮蓝(G-250)：美国Amresco公司；邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)、三氯乙酸、甲醇、乙腈：天津市富宇精细化工有限公司；C-18柱：大连依利特分析仪器有限公司。其他无特殊说明的试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TV-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；1260高效液相色谱仪(highperformance liquid chromatography,HPLC)：美国安捷伦公司；DHZ-D恒温摇床：江苏太仓仪器设备厂；DH-250A电热恒温培养箱：北京科伟仪器公司；3K15冷冻离心机：德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 检测方法

(1)发酵液中多肽含量测定［10］

蛋白水解所产生的α-氨基与邻苯二甲酸(OPA)在含有三氯乙酸溶液中会形成加成化合物,该化合物在波长340nm处具有强烈的吸收,以此来反映样品溶液中多肽的含量。按照亮氨酸标准曲线回归方程计算样品溶液中的多肽含量。

(2)蛋白水解度测定

蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)测定方法参照文献［11］。

(3)发酵液中ACE抑制率测定［12］

ACE以Hip-His-Leu(HHL)为底物催化产生马尿酸,其生成量与ACE的活性成线性关系,但加入ACE抑制肽后,会抑制ACE活性,从而产生更少的马尿酸,因此根据马尿酸的含量,对比ACE活性,即可获得ACE抑制率。

发酵液中ACE抑制率测定采用高效液相色谱法,其检测条件：C-18色谱柱(4.6 mm×250 mm)；检测波长228 nm；柱温20℃；流动相水∶甲醇=40∶60(均含0.1%甲酸,V/V)；流速0.8 mL/min；进样量10μL。

马尿酸标准曲线绘制：分别配制马尿酸浓度为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的标准溶液,过0.22μm的滤膜后,采用高效液相色谱法检测马尿酸含量,以峰面积(y)为纵坐标,马尿酸浓度(x)为横坐标绘制马尿酸标准曲线。

样品中马尿酸测定：50μL HHL溶液、20μL发酵上清液、50μL ACE溶液,于37℃恒温水浴中反应30 min,加入120μL乙腈终止反应,振荡10s,离心10min,取上清液10μL过0.22μm的滤膜,待测。以缓冲液替代反应体系中的发酵上清液为空白对照组。

1.3.2 实验方法

(1)菌种筛选

分别将米曲霉KL、米曲霉1、米曲霉2、米曲霉3、枯草芽孢杆菌90、黑曲霉3324、毛霉309活化后,按10%的接种量接种于液体筛选培养基中,细菌于37℃、140 r/min摇瓶培养48 h,真菌于28℃、140 r/min摇瓶培养72 h。培养后,4 000 r/min离心20 min,取上清液测定多肽含量和ACE的抑制率,以此为评价指标确定高产ACE抑制剂的生产发酵菌株。

(2)发酵条件优化

将菌株在液体筛选培养基中进行活化,并按10%接种量接种于液体发酵培养基(或浅盘固体培养基)中,以产生的ACE抑制率和蛋白水解度为考察指标,通过单因素试验对发酵培养方式(浅盘固态发酵、液体发酵)、发酵时间(0、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h)、培养基初始pH值(4、5、6、7、8、9、10)、培养温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)、基质(大豆分离蛋白)含量(2%、5%、10%、15%、20%、25%)等因素进行优化,寻求最佳的ACE抑制剂的发酵参数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以亮氨酸含量(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制亮氨酸标准曲线,结果见图1a；以蛋白质含量(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制蛋白质标准曲线,结果见图1b；以马尿酸含量(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,绘制马尿酸标准曲线,结果见图1c。

由图1a可知,亮氨酸标准曲线回归方程为y=2.103 9x-0.021 5,相关系数R2为0.994 5,表明二者线性关系良好；由图1b可知,蛋白质标准曲线回归方程为y=5.207 0x-0.004 7,相关系数R2为0.998 6,表明二者线性关系良好；由图1c可知,马尿酸标准曲线回归方程为y=5×106x+33 468,相关系数R2为0.999 3,表明二者线性关系良好。

图1 亮氨酸(a)、牛血清蛋白(b)及马尿酸(c)标准曲线Fig.1 Standard curves of leucine(a),bovine serum albumin(b)and hippuric acid(c)

2.2 菌株筛选

由图2可知,各个菌株在相同条件下,所产生的多肽含量差异明显,因为不同菌株在以蛋白为底物时,所产生的蛋白酶能力、性质不同,导致所生成的产物的能力不一。其中米曲霉KL、枯草芽孢杆菌BS90、米曲霉1、米曲霉2、米曲霉3都能产生超过0.5 g/L的多肽,分析可能是因为这些菌株都主要以产生蛋白酶为主,而毛霉和黑曲霉是以产淀粉酶或糖化酶为主,所以生成的多肽含量少于前者。理论上讲,多肽含量高,所具有能够抑制ACE活性的潜在的多肽也可能相对较多［13-14］,而从HPLC测定ACE抑制率的结果来看,米曲霉KL、枯草芽孢杆菌BS90、米曲霉1、2发酵液能够抑制ACE活性50%以上,其中,枯草芽孢杆菌BS90的抑制率最高,能够达到64.2%。且相对于真菌,芽孢杆菌在抗逆性、生长周期上具有明显的优势。因此,以枯草芽孢杆菌BS90作为下一步实验的出发菌株。

图2 不同菌株发酵液中的多肽含量及对ACE的抑制率的影响Fig.2 Effects of polypeptide contents in fermentation broth of different strains on ACE inhibition rate

2.3 发酵条件优化

2.3.1 发酵方式的影响

将枯草芽孢杆菌BS90活化后,分别接种在液体发酵培养基和浅盘固态培养基中,液体培养条件为37℃、140r/min、培养48 h,浅盘培养方式为37℃静置培养至出现基质拉丝状态,不同培养方式对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响结果见图3。

图3 不同培养方式对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响Fig.3 Effects of different culture methods on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

由图3可知,对枯草芽孢杆菌BS90而言,液体发酵条件下,蛋白的水解度19.6%,ACE抑制率68.42%都明显好于浅盘固态发酵的8.3%和21.15%。分析可能是因为对细菌而言,液体培养更有利于氧气及营养物质的传递,所产生的蛋白酶能够更有效的跟底物结合,而在固体状态下,底层基质的通氧及物质的传输都存在空间上的阻碍,所以发酵效率比较低,基质分解不完全。因此,液体发酵条件下更有利于蛋白的水解及ACE抑制率的提高。

2.3.2 培养时间的影响

不同培养时间对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度,ACE抑制率及OD600nm值的影响结果见图4。

由图4可知,菌体在4 h后进入快速生长期,16 h到达第一个生长高峰(OD600nm=1.49),在此阶段,菌体以消耗快速碳源为主,蛋白水解度(DH=5.9%)及发酵液中ACE抑制率(13.6%)稍有升高,但变化不明显。随着菌体的生长,菌体开始分泌蛋白酶作用于蛋白基质,基质开始慢慢分解,到24 h后出现一个快速分解期,这是因为菌体在培养24 h,产酶量增加,同时分解所产生的营养用于菌体的继续生长,出现了菌体OD600nm第二个快速增长期,而此时DH和ACE抑制率也开始快速增加。在40 h时,抑制率达到最大(72.1%),而后快速降低,这可能是因为在蛋白酶的作用下,具有抑制率的多肽在逐渐被降解,多肽产生量小于降解量。

图4 不同培养时间对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度、ACE抑制率及OD600 nm值的影响Fig.4 Effects of different culture time on protein hydrolysis degree,ACE inhibition rate and OD600 nm of B.subtilis BS90 fermentation broth

在整个发酵过程中,ACE抑制肽的活性随着蛋白基质的分解一直处于动态变化中,在前期随着蛋白被水解成各个分量的多肽,ACE抑制率会因多肽的积累而升高［15］,但随着水解的进行,具有ACE抑制率的多肽在蛋白酶的作用下继续水解而失去了ACE的抑制率。所以,对于水解程度的掌握是ACE抑制肽高效率生产的关键。因此,最佳发酵时间为40 h。

2.3.3 发酵液初始pH值的影响

不同发酵液初始pH值对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响结果见图5。

图5 不同初始pH对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响Fig.5 Effects of different initial pH on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

由图5可知,枯草芽孢杆菌BS90具有较强的pH耐受性,在初始pH值为4.0～10.0范围内都能够产生蛋白酶,分解底物生成具有ACE抑制率的多肽,但总体趋势上,枯草芽孢杆菌BS90喜偏碱性,分析可能是因为所产生的蛋白酶属于碱性蛋白酶,在弱碱性条件下活性最高［16］。当初始pH值为9.0时,所产生的抑制肽活性最高。因此,最佳的初始pH值为9.0。

2.3.4 培养温度的影响

不同培养温度对枯草孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响结果见图6。由图6可知,在30～40℃培养时,发酵液中ACE抑制率可达近80%,且在此温度范围内,培养温度对蛋白水解度与ACE抑制剂的影响不明显,都可作为枯草芽孢杆菌BS90发酵产ACE抑制肽的温度范围,但ACE抑制率最高(79.9%)出现在35℃,因此推荐35℃为本试验最佳的培养温度。

图6 不同培养温度对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响Fig.6 Effects of different culture temperatures on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

2.3.5 不同基质含量的影响

理论上,不同的基质含量直接决定了蛋白酶作用底物的多少,即在一定含量范围内,底物越多,所产生的具有ACE抑制率的多肽越多,但效率并不是最高的,实际上,底物过少,水解效率高,但由于菌体生长所需,所产生的多肽很快被消耗,ACE抑制率肽也不能被留存下来,所以,合适的蛋白基质含量不但关系到菌体的生长,而且还关系到ACE抑制剂产生的效率。不同基质含量对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响结果见图7。

由图7可知,2%的基质(大豆分离蛋白)含量,蛋白水解度高,但ACE抑制率低。当基质含量为5%时,无论是DH(89.1%)还是ACE抑制率(81.8%)都具有较好的效果。当基质含量≥10%,ACE抑制剂的活性下降不明显,但DH却明显降低。因此,选择基质含量5%最合适。

图7 不同基质浓度对枯草芽孢杆菌BS90发酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影响Fig.7 Effects of different substrate concentration on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

3 结论

本研究通过发酵法筛选获得了一株高产ACE抑制肽的枯草芽孢杆菌BS90,通过单因素试验优化了枯草芽孢杆菌BS90液态发酵生产ACE抑制肽的最佳条件,即大豆蛋白含量5%,初始pH值9.0,培养温度35℃,培养时间40 h时。在此优化条件下,DH达到89.1%,ACE抑制率达81.8%,较优化前分别提高69.5%、13.4%。

就微生物发酵法生产ACE抑制肽来讲,虽然原料充足,但由于ACE抑制肽本身就是一类多肽,分子质量大小不一,保守氨基酸组成、结构和抑制效应还未完全阐明［17］,这些对后期的分离纯化都会有一定的障碍,所以工业化应用还需要更加深入的研究。

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