侗族传统腌鱼中乳酸菌的分离鉴定与生物学特性

杜 斌， 吴文能， 王继玥， 周笑犁， 余 旭

(贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳 550005)

贵州黔东南苗族、侗族自治州的传统民族食品腌鱼，主要是以稻田养殖的鲤鱼为原料，将鲤鱼由背部剖开并除去内脏，盐腌16～24 h后，拌入糯米饭、辣椒粉及其他辅助香料入坛(桶)，放置于避光阴凉的地方自然发酵而成。腌鱼集甜、酸、辣、麻、咸于一体，口感软嫩，味道鲜美，可生吃，亦可煎、炸、烤、蒸，是当地民众招待客人的上乘佳肴[1-2]。但是由于传统手工工艺制作过程复杂，发酵时间较长，目前腌鱼还没有大规模生产和上市流通。乳酸菌作为传统发酵肉制品中的优势菌群，对产品风味的形成和营养品质变化起着至关重要的作用。目前对于少数民族传统发酵肉制品中乳酸菌的研究还比较缺乏，为此，本研究以侗族传统民族食品腌鱼为材料，对成品中的乳酸菌进行分离鉴定，并利用16S rRNA序列分析方法进行菌种鉴定，以期发现腌鱼中特有的菌种资源，为改进其传统工艺，进而发掘有益乳酸菌打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料 本试验用稻田鲤鱼捕捉于贵州省黔东南州黎平县，采用当地农户传统腌制方法腌制60d制成成品，另外收集当地农户的腌鱼成品，共3份样品。采样时严格按照GB/T4789.1—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验总则》操作。腌鱼样品分别编号为ZZY、CJY-1、CJY-2(ZZY为自制腌鱼，CJY-1、CJY-2为采集样品)。

1.1.2 培养基及主要试剂 MRS肉汤培养基，购自北京奥博星生物技术有限公司；PCR相关试剂，均购自北京全式金生物技术有限公司；微量生化鉴定管，购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

立式电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；2720 Thermal Cycler PCR仪，Applied Biosystems；DYY-5型电泳仪，北京市六一仪器厂；FR980凝胶成像仪，上海复日科技仪器有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株分离纯化 取3 g样品，剪碎后放入MRS液体培养基中，37 ℃恒温厌氧培养48 h后，对培养液进行10倍梯度稀释，取200 μL 104～107倍稀释液于含有2% CaCO3的MRS固体培养基中，37 ℃培养48 h，挑取有溶钙圈的单菌落接种于MRS固体培养基中，进行多次划线分离，挑选革兰氏阳性(G+)、过氧化氢酶阴性(H2O2-)的单菌落并进行保藏。

1.3.2 生理生化鉴定 参考《一般细菌常用鉴定方法》[3]，对分离纯化的乳酸菌进行生理生化鉴定。

1.3.3 16S rDNA分析

1.3.3.1 16S rDNA基因序列PCR扩增 取单菌落置于离心管中，加入20 μL无菌蒸馏水重悬，沸水浴10 min，12 000 r/min 离心5 min。上清中即含16S rDNA基因。采用细菌通用引物16S rDNA-F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，16S rDNA-R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCG CA-3′，以基因组DNA为模板PCR扩增16S rDNA基因。

25 μL反应体系：1 μL模板DNA，各2.5 μL引物(1 μmol/L)，12.5 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix，6.5 μL去离子水。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，25个循环；72 ℃ 2 min。用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3.3.2 菌株同源性分析及系统发育树的构建 将菌株序列在GenBank数据库中进行Blast同源性比对分析，运用MEGA 7.0软件的相邻计算法构建系统发育树，判断目的菌株的分类地位。

1.3.4 菌株生长能力和产酸能力测定 将待测菌株接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，以未接种菌液的MRS培养基作为空白对照，每隔2 h取200 μL培养液，采用酶标仪测定其D600 nm及培养液pH值。每个样平行测定3次。

1.3.5 温度对菌株生长的影响 将分离菌株接种于MRS液体培养基中，分别于15、20、30、37、45、50 ℃条件下培养24 h，以未接种菌液的培养基作为空白对照，D600 nm的测定方法同“1.3.4”节，研究温度对待测菌株生长代谢的影响。

1.3.6 NaCl浓度对分离菌株生长代谢的影响 将分离菌株接种于含盐量分别为0%、2%、4%、6%、8%、10%的MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，以未接种菌液的培养基作为空白对照，D600 nm测定方法同“1.3.4”节。

1.3.7 蛋白酶活性的测定 参照文献[4]进行，略有改动，分别以添加15%脱脂牛乳的MRS和营养琼脂固体培养基作为测定蛋白酶活性的专用培养基。将待测菌接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养24 h后，无菌吸取100 μL培养液，接种于蛋白酶检测专用培养基中，涂布均匀，于37 ℃培养 24 h，若菌落周围有透明环，则为阳性。

1.3.8 脂肪酶活性的测定 参照文献[5]进行，略有改动，分别以添加15%牛油、0.5%中性红指示剂的MRS和营养琼脂固体培养基作为测定脂肪酶活性的专用培养基。将待测菌株接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养24 h后，无菌吸取 100 μL 培养液，接种于脂肪酶检测专用培养基中，涂布均匀，于37 ℃培养24 h，若培养基上出现红色斑点，则为阳性。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

本试验采用MRS选择性培养基，对3个样品中的优势乳酸菌群进行分离及纯化。经显微观察菌落形态、革兰氏染色、过氧化氢酶试验，得到G+和H2O2-菌株共16株，初步鉴定均为乳酸菌。其中从样品ZZY中分离得到7株，从CJY-1中分离得到6株，从CJY-2中分离得到3株。所获菌株的菌落形态多为边缘整齐、表面光滑或稍粗糙，MRS培养基中的菌落呈乳白色或浅黄色凸起的圆形。镜检观察全部为杆状或短杆状，成单、对或堆排列。

2.2 生理生化鉴定

对上述16株乳酸菌进一步进行生理生化鉴定试验，结果见表1。可以看出，所有乳酸菌产酸，不可水解明胶和淀粉；查阅《一般细菌常用鉴定方法》《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[3，6]，初步确定乳酸菌主要为消化乳杆菌(8株)、植物乳杆菌(4株)、草乳杆菌(2株)和发酵乳杆菌(2株)。可以看出，消化乳杆菌为侗族传统腌鱼产品中的优势乳酸菌之一，从菌株数量来看较多。该结果与盐干带鱼微生物区系研究较为相似[7]，但与其他传统肉制品的微生物区系研究具有较大的差异，如干腌牛肉(Cecina de Leon)以及云南干腌火腿中乳酸菌属细菌以植物乳杆菌、发酵乳杆菌为优势菌[8]，这可能是由加工原料及加工工艺的不同造成的。

2.3 16S rDNA分析

根据生化鉴定结果，分别对菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3 和CJY2-3进行16S rDNA分子生物学鉴定，将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，如图1所示，4株待测菌条带明亮清晰，且无明显拖尾，均在1 500 bp附近，可以进行序列检测。

2.4 测序结果分析

将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，通过BLAST，将所测定的菌株序列结果与GenBank数据库中已知菌株序列进行比对，寻找与目的基因序列同源性最高的已分类的菌种，然后用软件MEGA 6进行序列分析，构建系统发育树。如图2所示，所分离菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3和CJY2-3的遗传进化分别与已知消化乳杆菌(LactobacillusalimentariusW369、L.alimentariusIMAU80036)、已知植物乳杆菌(L.plantarumNi344、L.plantarumWCFS1)、已知草乳杆菌(L.graminisLMG 9825)和已知发酵乳杆菌(L.fermentumKFC、L.fermentumM17-1)同处于一个分支，同源性高达99%。这一结果与生化鉴定结果完全一致。

2.5 菌株生长特性

2.5.1 生长曲线的测定 对菌株ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3和CJY2-3进行生长曲线研究。由图3可知，4株乳酸菌中只有草乳杆菌ZZY-3在培养6 h后进入生长对数期，18 h后才趋于平缓生长，而其他4株菌均表现出相似的生长特性，在4 h 后进入对数生长期，14 h后达到稳定生长期，比较D600 nm可知，消化乳杆菌ZZY-6、植物乳杆菌CJY1-1和发酵乳杆菌CJY2-3的生长速率要高于草乳杆菌ZZY-3，更早到达平台期。

表1分离菌株的生理生化鉴定

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“±”表示11%～89%的菌株为阳性。表2同。

2.5.2 产酸性能的测定 图4表明，ZZY-6、CJY1-1、ZZY-3 和CJY2-3等4株待测菌株均有较好的产酸能力，培养 4 h 后，菌株ZZY-6、CJY1-1和CJY2-3发酵液的pH值均快速下降。培养14 h后，这3株菌培养pH值均下降到4.0左右。而菌株ZZY-3培养16 h后发酵液pH值才降到4.0，这与菌株生长情况基本是对应的。结果表明，分离菌株符合发酵肉制品发酵剂的要求，可快速使环境 pH值下降，因此能抑制腐败菌的生长[9]，提高产品的安全性。

2.5.3 发酵温度对分离菌株生长代谢的影响 温度对于菌株生长及产酸影响较大，由图5可知，环境温度在15～37 ℃范围内时，分离菌株的D600 nm逐渐升高，当温度高于40 ℃时，其D600 nm开始下降；当温度继续升高，菌株的生长受到极大抑制，因此分离菌株最适发酵温度为37 ℃。

2.5.4 NaCl浓度对生长的影响 传统腌鱼腌制时通常要加入一定量的NaCl，鱼体内NaCl含量较高，而对NaCl的耐受能力是选择发酵肉制品发酵剂的一个重要因素， 筛选出的菌株通常要求至少能够在6%的NaCl浓度下正常生长[10]。本试验考察了NaCl浓度对4株菌株生长的影响，如图6所示，随着NaCl浓度的升高，4株菌株的生长均受到不同程度的抑制，随着NaCl浓度增大，抑制作用越强；当NaCl浓度在0～4%时，菌株受到的抑制作用较小；当NaCl浓度达到6%时，菌株生长力均有所下降但仍能生长，表明这4株菌对NaCl具有一定的耐受能力，该分离菌株在腌鱼发酵过程中有较强竞争力，可作为相关肉制品的备选发酵剂。

2.5.5 蛋白酶活性与脂肪酶活性测定 乳酸菌蛋白酶活性与脂肪酶活性，是筛选性质优良、稳定性强的工业生产菌株的主要指标[11-13]。本研究初步分析了4个菌株的相应酶活性。由表2可知，只有植物乳杆菌CJY1-1具有蛋白酶活性，而其余3株菌株均未检测到蛋白酶活性；这4株菌株脂肪酶的检测结果均为阴性，表明分离得到的菌株均不具有脂肪酶活性。

表2分离菌株的蛋白酶活性和脂肪酶活性

3 结论

由于地域不同以及制作工艺的差异，侗族传统腌鱼中优势乳酸菌群也略有不同。本研究从3份样品中共分离出16株乳酸菌。经生理生化鉴定，初步确定乳酸菌主要为消化乳杆菌(8株)、植物乳杆菌(4株)、草乳杆菌(2株)和发酵乳杆菌(2株)，分别选取1株菌株，通过16S rDNA测序分析进行进一步确认。对分离菌株的生长特性进行研究发现，所得菌株均具有较好的生长能力和产酸性能，并且表现出较高的耐盐能力，而且检测到植物乳杆菌CJY1-1具有一定的蛋白酶活性，这些研究数据为了解侗族传统腌鱼中的乳酸菌群、揭示其发酵机制，以及工业化实行纯菌种生产的腌鱼产品提供了菌种支持，并为发掘侗族传统腌鱼中的益生乳酸菌打下了基础。

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