亚侧耳遗传多样性的ISSR和SRAP综合分析

刘梦雪， 荣成博， 牛玉蓉， 宋 爽， 刘 宇， 陈青君

(1.北京农学院植物科学技术学院农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206；2.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所/北京市食用菌工程技术研究中心，北京 100097)

亚侧耳(Hohenbueheliaserotina)，别称元蘑、冻蘑、黄蘑等，隶属于真菌门担子菌亚门层菌纲伞菌目白蘑科侧耳属。亚侧耳富含蛋白质、氨基酸、多种不饱和脂肪酸和微量元素，是一种高蛋白、低脂肪的健康食品。亚侧耳分布于河北、黑龙江、吉林、广西、陕北、四川等地，在吉林长白山区自然分布较多，是东北地区著名的土特产[1]。由于长期大量采摘，亚侧耳野生存留量已逐年减少[2]。

食用菌种质资源是优良品种育种的基础材料，育种成效除了取决于所掌握种质资源的数量，还在很大程度上取决于对这些种质资源多样性的遗传特性的掌握。分子标记作为食用菌遗传多样性研究中的一个重要手段，其应用越来越广泛[3]。

简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat，简称ISSR)是由Zietkiewicz等于1994年创建的一种DNA标记技术[4]，结合了随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphic DNA，简称RAPD)和简单重复序列(simple sequence repeats，简称SSR)方法的优点，是一种具有稳定性和高重复性的分子标记方法，被广泛应用于食用菌方向。冯伟林等利用11个ISSR引物对12个杏鲍菇生产性菌株基因组DNA进行PCR扩增，发现利用ISSR分子标记技术能够将杏鲍菇菌株区分开，并将12个杏鲍菇菌株聚为3个群，清晰地揭示了杏鲍菇菌株间的遗传关系[5]。

序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，简称SRAP)是一种由美国加州大学Li等应用的分子标记技术[6]，该技术利用上游引物针对外显子区域，下游引物针对内含子区域、启动子区域进行特异性扩增，上游引物和下游引物自由结合，配对出不同的组合进行反应。许峰等利用9对SRAP引物对22个白色金针菇进行聚类分析，在相似系数为0.820水平时，将供试菌株分为五大类，此技术揭示了北京地区金针菇菌株的遗传多样性[7]。

由于每个方法的开发原理不同，聚类分析结果通常会存在较大的差异，将多个分子标记综合运用能最大地优化聚类分析结果[8]。刘婧宇等运用ISSR、RAPD和SRAP对26株香菇进行聚类分析，综合分析结果表明，供试菌株间的遗传相似系数范围为0.49～0.97，在相似系数为0.61时，将26株香菇分为3个类群[8]。

笔者所在实验室对全国范围内收集到的亚侧耳菌株进行收集、保存，通过ISSR和SRAP分子标记综合分析，对19个亚侧耳菌株进行遗传多样性研究，以期为杂交育种中亲本的选择和种质资源保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 试验材料 本研究所用菌株的名称及来源见表1。

1.1.2 试剂及培养基 马铃薯、葡萄糖、琼脂粉(BD Difco)、蛋白胨(OXIOD)、维生素B1、分析纯磷酸二氢钾、硫酸镁等化学试剂，均购自国药集团北京化学试剂有限公司；2×TaqPCR MasterMix，购自北京艾德莱生物科技有限公司；琼脂糖，购自西班牙Biowest公司；所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon)合成。

PDA综合培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、硫酸镁1.5 g、磷酸二氢钾3 g、蛋白胨5 g、维生素B110 mg，加水至1 000 mL。

表1供试菌株及其来源

1.1.3 仪器 主要仪器包括PCR仪(Eppendorf Mastercycler Gradient)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、紫外-可见分光光度计(Labtech UV9100)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司，DYY-Ⅲ-12B)、电子分析天平(奥豪斯仪器上海有限公司)、台式高速冷冻离心机(Eppendorf 5415R)、移液器(Eppendorf)等。

1.2 试验方法

1.2.1 ISSR和SRAP分析 取在PDA平板上活化7～10 d的亚侧耳菌种，刮取少量菌丝作为试验材料，DNA的提取参照许峰等的方法[9]，ISSR扩增反应体系及扩增程序参照冯伟林等的方法[10]；SRAP扩增反应体系及扩增程序参照边银丙等的方法[11]，所用引物见表2、表3。取7 μL PCR扩增产物，按2%的量加入SYBR Safe DNA Gel Stain(Invitrogen)进行琼脂糖凝胶电泳，置于紫外凝胶成像系统上观察并拍照记录。

表2ISSR分析用引物

1.2.2 数据处理及分析 在同一水平上将扩增出的强带或可分辨性好的弱带均视为扩增阳性，并赋值“1”，将未扩增出的条带视为扩增阴性，赋值“0”，用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析。

表3SRAP分析用引物

2 结果与分析

2.1 供试菌株ISSR分析结果

以菌株JZB2121009、JZB2121011、JZB2121017为模板，筛选出13条扩增条带稳定、清晰、重复性好的ISSR引物(表2)。以提取的19个供试亚侧耳菌株的基因组DNA为模板，使用经过对不同引物的PCR扩增筛选获得的13条引物(表2)，在供试菌株上PCR产物的电泳效果较好，每个菌株都可以通过PCR扩增出DNA条带，且条带稳定、清晰、重复性好、分布合理。13条引物共扩增出154条DNA片段，其中多态性条带数为145个，平均多态性为94.2%(表4)。由图1可以看出，不同引物扩增出的DNA条带数不等，其序列长度多为200～5 000 bp，其中包含了丰富的DNA多态信息。

2.2 供试菌株的SRAP分析结果

以提取的19个供试亚侧耳菌株的基因组DNA为模板，使用经过不同引物的PCR扩增筛选获得的13对引物(表3)，在供试菌株上PCR产物的电泳效果较好，每个菌株都可以通过PCR扩增出DNA条带，且条带稳定、清晰、重复性好、分布合理。13对引物共扩增出147条DNA片段，其中多态性条带数为140条，平均多态性为94.5%(表5)。

表4ISSR多态性

表5SRAP多态性

由图2可见，不同引物扩增出的DNA条带数不等，其序列长度大多为200～5 000 bp，其中包含了丰富的DNA多态信息。

2.3 供试菌株聚类分析结果

综合26条(对)引物扩增出的301条DNA片段，其中多态性条带285条，多态性达94.7%。用NTSYSpc 2.10软件对19个亚侧耳供试菌株进行聚类分析，获得各菌株间的聚类结果(图3)。

3 结论与讨论

笔者收集了不同地区的19个亚侧耳菌株，并对其基因组DNA进行ISSR、 SRAP扩增和遗传多样性分析。聚类分析结果显示，19株亚侧耳菌株间的遗传相似系数范围为0.67～0.85。在相似系数为0.70时，可将19个供试菌株分为五大类。

聚类分析结果显示，4号、5号、12号和15号菌株均来自白河自然保护站的同一海拔、同一区域，在聚类分析结果中也聚为一簇，说明品种存在一定的地域性；野生驯化种18号、19号菌株与野生采集种14号菌株亲缘关系较近，说明18和19号菌株可能都是由同一个品种选育获得的，且原始菌株与14号菌株为相近或相同品种；2号、17号菌株是来自相同地区的相同菌株，二者亲缘关系很近，甚至可能同物异名，目前的聚类分析手段暂不能区分，有待用更多的引物进一步进行筛选或利用其他分子标记方法辨别；同样来自白河自然保护站的14个菌株中，1号、2号、6号、8号、9号、12号和17号菌株均采集于椴树倒木上，3号、4号、5号、11号、12号、14号和15号菌株均采集于蒙古栎倒木上。聚类分析结果显示，品种间亲缘关系与其生长的环境并没有直接联系。

目前国内利用分子标记技术对双孢菇[12]、金针菇[13]、杏鲍菇[14]和黑木耳[15]等进行遗传多样性分析的报道较多，但却暂无对亚侧耳品种进行遗传多样性分析的报道。本研究对全国范围内收集的19个亚侧耳菌株进行了遗传多样性的系统分析，对现有种质资源遗传多样性进行评价，为下一步选取遗传差异较大的亚侧耳菌株进行杂交育种工作打下了基础。

参考文献：

[1]袁文斌，邹 莉，赵宝山，等. 元蘑不同栽培种培养基的比较试验[J]. 中国食用菌，2009，28(4)：15-17.

[2]辛树权，赵骥民，沈 永. 不同培养条件对元蘑菌丝生长的影响[J]. 北方园艺，2013(10)：140-142.

[3]吴学谦，李海波，魏海龙，等. SCAR分子标记技术在香菇菌株鉴定上的应用研究[J]. 菌物学报，2005，24(2)：259-266.

[4]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) -anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20(2)：176-183.

[5]冯伟林，蔡为明，金群力，等. ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异研究[J]. 中国食用菌，2009，28(1)：47-49.

[6]Li G，Quiros C F. Sequence -related amplified polymorphism (SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging inBrassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103(2/3)：455-461.

[7]许 峰，刘 宇，王守现，等. 北京地区白色金针菇菌株的SRAP分析[J]. 中国农学通报，2010，26(10)：55-59.

[8]刘靖宇，宋秀高，叶 夏，等. 香菇菌株遗传多样性ISSR、RAPD和SRAP综合分析[J]. 食用菌学报，2011，18(3)：1-8.

[9]许 峰，刘 宇，王守现，等. 一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法[J]. 生物技术，2011，21(1)：43-44.

[10]冯伟林，蔡为明，金群力，等. ISSR分子标记分析杏鲍菇菌株遗传差异研究[J]. 中国食用菌，2009，28(1)：47-49.

[11]边银丙，宋小亚. 几种新型DNA分子标记及其在食用菌研究中的应用[J]. 食用菌学报，2006，13(1)：78-81.

[12]顾 敏，沈颖越，金群力，等 .双孢蘑菇SSR分子标记开发及其在遗传多样性分析中的应用[J]. 浙江农业学报，2013，25(5)：987-993.

[13]宿红艳，王 磊，明永飞，等. ISSR分子标记技术在金针菇菌株鉴别中的应用[J]. 生态学杂志，2008，27(10)：1725-1728.

[14]谭秀梅，李 永，朴春根，等. 杏鲍菇遗传多样性的SRAP和ITS分析[J]. 农学通报，2016，32(12)：110-115.

[15]马庆芳，张介驰，张丕奇，等. 用ISSR分子标记鉴别黑木耳生产菌株的研究[C]. 武汉：全国食用菌中青年专家学术交流会，2006.