对氟苯甲醛缩去甲去氢斑蝥素酰亚胺的合成及荧光性质研究

王 威，曾 造*,2

(1.贵州工程应用技术学院 化学工程学院，贵州 毕节 551700；2.贵州工程应用技术学院化学化工实验教学中心，贵州 毕节 551700)

斑蝥素是从传统中药斑蝥虫中提取出来的具有抗菌性药物，它对肿瘤、癌症具有很好的治疗效果，具有增加白细胞数、不克制免疫系统等功效[1]。但是，斑蝥素有剧毒会对人体消化系统、肝脏等有很大的副作用[2]，这也限制了它在医疗上的推广使用。斑蝥素的衍生物-去甲去氢斑蝥素酰亚胺类化合物具有良好的抗菌、抗癌、抗肿瘤等生物活性[3]，且该类药物的毒性比斑蝥素低。研究表明，氟代苯甲醛可用于合成抗病毒药、解热镇痛消炎药[4]。为了合成药用价值高、毒副作用小的新型药物，本文以呋喃和顺丁烯二酸酐为原料，合成对氟苯甲醛缩去甲去氢斑蝥素酰亚胺(a)，合成路线见图1。并通过荧光光谱法研究了目标化合物与牛血清蛋白的相互作用，探索其猝灭机理、猝灭常数和作用力类型等，为了解该类药物在体内的运输、储存和作用机理等信息提供实验依据。

图1 目标产物(a)合成路线

1 实验部分

1.1 实验仪器及药品

仪器：600 MHz 核磁共振仪(TMS 为内标，瑞士 bruker 公司)；F-2007 FL 荧光分光光度计(日本日立公司)；恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；超声清洗仪(上海冠特超声有限公司)；电子分析天平；冷冻药品保存柜(中科美菱)。

药品：四氢呋喃，呋喃，顺丁烯二酸酐，对氟苯甲醛，牛血清蛋白(美国Sigma公司)，Tris-HCL缓冲溶液(含0.1 mol/L的NaCl)pH值=7.4，实验试剂保存在4℃下，备用。

1.2 目标产物的合成

参照文献[5]称取9.80 g(0.1 mol)顺丁烯二酸酐于反应容器中，加入适量的乙醚使其全部溶解。在室温下滴加8.70 mL(0.12 mol)呋喃并不断搅拌25 min，密封静置过夜，有白色晶体析出，过滤，称重得12.6 g白色针状晶体物质去甲去氢斑蝥素(1)，用无水乙醇重结晶，产率66.7%。参照文献[6]的合成方法，称取1.66g(0.01 mol)去甲去氢斑蝥素于100 mL的三颈烧瓶中，加入适量的无水乙醇使其刚好溶解，待化合物(1)全部溶解后，缓缓滴加1.00 g(0.02 mol)水合肼，加热回流20 h，冷却结晶抽滤，用无水乙醇重结晶、干燥称重得1.2 g的白色产物N-氨基去甲去氢斑蝥素酰亚胺(2)。根据文献[7]的合成方法，称取1.08 g化合物(2)于250 mL的三颈烧瓶中，加入适量的无水乙醇使其全部溶解，加入6.00～1.2 mmol的对氟苯甲醛，用TLC追踪反应，加热回流5h，冷却结晶后抽滤，以无水乙醇为溶剂加热溶解重结晶，干燥后得目标产物a。

1.3 荧光分光实验方法

在10 mL容量瓶中加入1.0 mL Tris-HCL溶液(pH值=7.4)、1.0 mLBSA溶液和不同体积的去甲去氢斑蝥素酰亚胺缩对氟苯甲醛溶液，并用超纯水定容，摇匀静置15 min。分别在290、300、310 K的恒温水浴锅中恒温40 min,发射狭缝和激发狭缝的宽度都为5 nm，以286为激发波长在300～450 nm扫描产物a与BSA混合液的荧光发射光谱[8]。

2 实验分析与结果

2.1 产物结构

去甲去氢斑蝥素(1)，收率66.7%，m. p.117.4～119.3 ℃。1H NMR ((CH3)2CO-d6，600 MHz)，δ：6.62(d，2H，J=0.6 Hz，CH=CH)；5.28(s，2H，HCOCH)；3.20(s，2H，HCCH)，去甲去氢斑蝥素(1)的熔点、氢谱与参考文献[3]相符合。N-氨基去甲去氢斑蝥素酰亚胺(2)为白色固体，m.p.137.3 ～ 139.4 ℃(文献值[9]为139 ～ 140.5 ℃)。对氟苯甲醛缩氨代去甲去氢斑蝥素白色晶体，产率43%。m.p.156.5～157.8 ℃。1H NMR ((CH3)2CO-d6，600 MHz)，δ：9.06(s，1H，N=CH)；7.97(s，2H，Ar-H)；7.28(s，2H，Ar-H)；6.64(d，2H，J=9.6 Hz，CH=CH)；5.25(s，2H，HCOCH)；3.14 (s，2H，HCCH)。13C NMR((CH3)2CO-d6，150 MHz)，δ：48.48，79.15，115.92，129.99，130.74，136.33，160.54，164.15，173.09。

2.2 目标产物与BSA的猝灭机理

2.2.1 荧光猝灭光谱

蛋白质分子中主要有苯丙氨酸、色氨酸等一系列残基产生的内源荧光，在波长为286 nm光的激发作用下，340 nm左右会出现色氨酸残基产生的荧光发射峰。实验中，固定BSA浓度不变，加入相同浓度不同体积的对氟苯甲醛去甲去氢斑蝥素酰亚胺缩溶液进行荧光检测，可得到荧光猝灭谱图。由图2可以看出，随着药物浓度的增大，BSA的最大荧光强度有一定规律变化，其变化为随着浓度的增大而减小，说明去甲去氢斑蝥素酰亚胺缩对氟苯甲醛对BSA有猝灭作用。

1～7：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0(C(a) =5)图2 产物对BSA的荧光猝灭光谱Fig.2 Fluorescence quenching spectra of product-BSA

2.2.2 猝灭机理与常数

药物对BSA的猝灭作用分为动态猝灭与静态猝灭。对动态猝灭，温度升高，基态复合物稳定性减小，猝灭常数也随之减小；对静态猝灭，随着温度的增高，猝灭常数增大。药物对BSA的作用过程遵循Stern-Volmer方程：

F0/F=1+KqT0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式(1)中，Ksv是猝灭常数；F0是BSA溶液的荧光强度；F是加入药品后BSA溶液的荧光强度；Kq是双分子猝灭的速率常数；[Q]是猝灭剂Q的浓度；T0是猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命，约等于10-8s。根据方程式(1)，作去甲去氢斑蝥素酰亚胺缩对氟苯甲醛对BSA猝灭的Stern-Volmer曲线(图3)，直线斜率为猝灭常数。由图3可知，290、300和310 K的Ksv分别为3.08×104L/mol(R=0.9979)、3.73×104L/mol(R=0.9918)、3.92×104L/mol(R=0.9948)。随着温度的升高，BSA的猝灭常数升高，可以推出该过程是动态猝灭。可以根据Ksv= KqT0计算出相应的Kq等于3.08×1012、3.73×1012、3.92×1012L/(mol·s)。Kq值均大于生物分子的最大动态猝灭速率常数(2.0×1010L/(mol·s),这可以得出目标产物对BSA的荧光猝灭作用包含了静态猝灭和动态猝灭两类。

图3 目标产物与BSA荧光猝灭的Stern-Volmer曲线Fig.3 The Stern-volmer curves of fluorescence of BSA quenching by target products

2.2.3 结合常数和结合位点数

目标产物对BSA存在静态猝灭和动态猝灭，由此我们可以用静态猝灭公式(2)计算其结合常数KA及结合位点数n：

Lg[(F0-F)/F]=KA-nLg [Q]

(2)

[(F0-F)/F]对 [Q]作图(图4)，由图中的截距可以求DNCT与BSA的KA值，直线斜率可以算出两者的结合位点数n，结果如表1所示。

图4 不同温度下产物对BSA的Lineweaver-Burk曲线Fig.3 Lineweaver-Burk curves of the product-BSA at different temperatures

表1 产物与BSA的结合常数和结合位点数Tab.1 The binding constant and binding points for the system of product -BSA

2.2.4 相互作用力

分子之间的主要作用力有范德华力、疏水作用力、静电引力等。Ross的判断规则如下：当Δ S<0，ΔH<0，主要表现为范德华力；当ΔS>0，ΔH>0，主要表现为疏水作用力；当ΔS>0，ΔH<0，主要表现为静电作用力。当温度变化范围很小时，我们可以把荧光猝灭进程中的ΔH看为常数，根据下面的三个方程式计算出ΔH、ΔS，由此就可以判断产物与牛血清蛋白的作用力类型。

ΔG=-RTlnK

(3)

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

根据290、300、310 K三个温度下计算出的结合常数，我们可以计算出目标产物与牛血清蛋白的相互作用的热力函数值，值见表2。根据表中的值可以得出目标产物与牛血清蛋白之间是通过疏水作用力而结合在一起的，并且ΔG<0我们可以得出他们之间是吸热熵增加的自发过程。

表2 目标产物和BSA的热力学参数Tab.2 Thermodynamic parameters of BSA- product

2.3 同步荧光分析

因为氨基酸残基的最大波长容易受到微环境的影响，实验进一步利用同步荧光光谱分析其分子对蛋白质构象的变化。固定波长差分别为Δλ=15 nm与Δλ=60 nm的同步荧光能分别体现酪氨酸残基和色氨酸残基的构象变化。有图5可知，当随着药物浓度增加，酪氨酸残基和色氨酸残基的均产生荧光猝灭，但Δλ=60 nm色氨酸残基的最大发射波长略有红移，从而引起蛋白质构象发生变化。

图5 同步荧光光谱Fig.5 Synchronocs fluorescenee speetra

3 结论

本文合成了对氟苯甲醛缩去甲去氢斑蝥素酰亚胺，并且通过荧光光谱法研究了其与牛血清蛋白之间的相互作用。研究表明，目标产物与牛血清蛋白之间存在两种猝灭作用即静态猝灭与动态猝灭。在290、300和310 K温度下，目标产物与牛血清蛋白的结合常数与结合位点数分别为3.37×104，2.7×104，2.69×104L/mol和0.947,1.16,1.20；并且它们之间是通过疏水结合力结合在一起。该实验结果可为该类药物在体内的运输、分布和药物活性提供一些参考价值。

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