运脾颗粒对功能性消化不良大鼠胃肠运动及胃肠激素SP、VIP表达的影响

马国珍，宋瑞平，舒劲，张晓明，王煜，卢雨蓓

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.中国中医科学院，北京 100700

功能性消化不良(Functional dyspepsia，FD)是一种临床最常见的非器质性胃肠病之一，易受各种因素的影响，造成病情反复，临床诊治欠佳，对病患的日常生活造成极大的困扰。一项全球调查显示，FD患者仅表现为上消化症状的占20%～50%，而以上腹痛为主的占8%～50%[1]。另一项研究表明，FD的总患病率为12%～15%，亚洲FD患病率为10%～23%，而我国FD的患病率比亚洲发达国家更高[2～3]。此外，与常人相比，FD患者在情感职能、精神健康等6个维度中的分数明显降低，提示FD患者的心理及生理均受到不同程度的影响[4]。FD的发病机制至今仍无明确阐释，且治疗仍以对症支持为主，包括抑酸护胃、

促胃动力、助消化及抗幽门螺杆菌等。其中多潘立酮为促胃动力的常用药物，但由于其经肝脏、肾脏代谢，严重肝肾功能不全者不宜长期使用[5]，且该药会加重患有心脏疾病患者的心律失常，因此临床应用受到限制。随着中医药对FD研究的深入，基于整体观和辨证论治，从“病证结合”角度追溯FD可能的发病本质，为诊治FD开拓了新视角。运脾颗粒为甘肃省中医院院内制剂，本研究旨在从胃肠激素的角度探讨运脾颗粒的可能作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物来源 健康雄性SPF级SD大鼠70只，日龄60天左右，体质量(200±20)g，均由甘肃中医药大学SPF级动物实验中心提供，实验动物质量合格证号：NO.62001000000299。饲养于SPF级动物实验室，相对湿度控制在30%～60%，温度控制在20～24℃，室内照明、通风良好，进入实验室人员须穿戴消毒之后的防护服。所有大鼠均予以常规饲料及自由饮水，平均2天1次更换垫料，常规适应性喂养1周，大鼠未有异常表现则纳入实验。实验过程对动物处置应符合SPF级实验室要求。实验单位使用许可证编号：SYXK(甘)2015-0005。

1.2 实验药品 运脾颗粒(甘肃省中医院制剂中心，规格6 g/袋，甘药制字Z09001927)，主要由党参、白术、茯苓等药物组成；多潘立酮片(西安杨森制药有限公司，规格10 mg/片，国药准字：H10910003)；0.9%生理盐水(四川科伦药业股份有限公司，国药准字：H51021157)。

1.3 仪器及试剂 低温高速离心机(Kendro公司)；C1000荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)；PRO200组织匀浆器(Bio-Gen)。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.4 动物分组 大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法随机分为空白组15只，造模组55只，造模结束后每组随机抽取5只，以验证模型是否成功。将造模成功的50只大鼠随机分为模型组、运脾颗粒低、中、高剂量组及多潘立酮组，每组10只。

1.5 造模方法 采用适度夹尾刺激、不规则喂养和苦寒泻下[6～8]的复合因素造模法制成肝郁脾虚型FD大鼠模型。除空白组外，其余各组按“夹尾刺激法加不规则喂养”造模14天，结合“苦寒泻下”造模7天。即用长海绵钳夹大鼠尾巴末端近1/3处，以令其尖叫挣扎但不破皮为度，使它发怒并和其他大鼠厮打(若有抓伤，予以碘伏消毒伤口，预防感染)，每次每组刺激30 min，每天2次；期间大鼠正常饮水，单日喂食，双日禁食，并于禁食日予以番泻叶水煎剂灌胃，每天2次，连续造模14天。记录每次喂食量及造模前、造模后、治疗后大鼠的体质量。

1.6 药物制备及干预 药品均按照人与大鼠的等效剂量换算(参照人与动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表)，换算系数为0.018。换算后运脾颗粒高、中、低剂量组将运脾颗粒分别配置成0.216 g/mL、0.108 g/mL、0.054 g/mL的混悬液，均以10 mL/(kg·d)灌胃；多潘立酮组将多潘立酮片研碎成粉末制成0.27 mg/mL的混悬液，以10 mL/(kg·d)灌胃；空白组与模型组的大鼠每天用生理盐水以10 mL/(kg·d)灌胃，每天2次，给药14天。番泻叶水煎剂[8]：以100 mL水含5 g番泻叶的比例，将番泻叶置于沸水中浸泡，按20 mL/(kg·d)灌胃。用于胃排空及小肠推进率测定的营养性半固体糊制备[9]：取羧甲基纤维素钠5 g，溶于100 mL蒸馏水中，分别加入淀粉4 g、奶粉8 g、糖4 g、碳素墨水2 mL，搅拌均匀，配成约150 mL的黑色半固体糊，按10 mL/(kg·d)灌胃。

1.7 标本采集与处理 各组大鼠末次给药后，禁食不禁水24h，次日上午以营养性半固体糊10mL/(kg·d)灌胃。30 min后，颈椎脱臼处死。充分暴露腹腔，结扎贲门及幽门，取出完整的胃，用滤纸吸干后称胃全重；然后沿大弯侧剪开，冰盐水冲去胃内容物，再次滤纸吸干称胃净重，均作记录。分离小肠，平铺于无菌方巾，用于测小肠推进距离。取胃窦组织、结肠组织(距肛门7～10 cm处)，将胃窦、结肠组织用预冷的生理盐水快速冲洗处理，放入冻存管，移入-80℃低温冰箱中保存备用，并逐一纪录。

胃排空率=1-[(胃全重-胃净重)÷半固体糊]×100%，小肠推进率(%)=[碳末推进距离(幽门至碳末推进前端)/小肠总长度(幽门至回盲部)]×100%。

1.8 RT-PCR法检测各组大鼠胃肠组织中SP、VIP mRNA表达 引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：β-actin，Forward：5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，Reverse：5'-TTTAA TGTCACGCACGATTTC-3'， 150 bp； SP， Forward：5'-ATCGGTGCCAACGATGATCT-3'， Reverse： 5'-CC GTTTGCCCATTAATCCAA-3'，150bp；VIP，Forward：5'-CCAGAAGGAAAGACCCAAGGA-3'， Reverse： 5'-CCTGTCATCCAACCTCACTGAA-3'，150 bp。提取胃窦及结肠组织RNA，测定RNA纯度及浓度，应用PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒进行反转录，反应体系如下：5×PrimeScriptRBuffer 4 μL，总RNA 1 μg，RNase Free dH2O 15 μL，总反应体系是20 μL，反应条件：37℃反应 15 min，85℃ 5 s，得到的反应产物(cDNA)，置于-20℃冰箱保存。应用实时荧光定量PCR试剂盒检测mRNA的表达，依据说明书进行操作，反应体系如下：2×SYBRRPrimix Ex Taq TM 25 μL，引物 F(10 μM)1 μL，引物 R(10 μM)

1 μL，Rnase Free dH2O 18 μL，cDNA 4 μL，总反应体系是50 μL。反应条件：95℃变性2 min，95℃10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环。采用Comparative Ct(△△Ct)法分析样本中SP及VIP基因的相对表达量，以2-△△Ct表示，Ct值代表循环阈值。

1.9 统计学方法 运用SPSS21.0进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，先对资料进行正态性检验。符合正态分布的计量资料，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐者用LSD法，不齐者用 Dunnett’s T3 法。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况观察 造模初期，造模组大鼠在夹尾刺激时反应强烈，怒叫，易激惹，造模过程中有排便现象。解除夹尾刺激后，大鼠出现相互撕咬或厮打现象，精神状态极为不安。而在造模后期，造模组大鼠对夹尾剌激的反应减弱，有撕咬、尖叫但程度有所减轻，解除夹尾刺激后，大鼠呈高警觉对峙状态；并逐渐地出现精神萎靡，眯眼，活动减少，喜扎堆缩于角落，食量减少，毛发粗乱枯槁无华，足蹼、鼻尖、耳缘黏膜苍白，粪便时干时稀，拉尾排便反应阳性。给药干预结束后，空白组大鼠精神状态佳，毛色鲜亮，活跃灵敏，进食、体质量较之前均有所增加。各治疗组大鼠均不同程度出现情绪平缓，毛发光泽有所改善，进食量增多，活动度增加，粪便逐渐成形，干稀适中。

2.2 各组大鼠胃排空率、小肠推进率比较 见表1。与空白组比较，模型组大鼠胃排空率及小肠推进率均有不同程度的下降，差异均有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，运脾颗粒各剂量组及多潘立酮组大鼠胃排空率及小肠推进率显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。与多潘立酮组比较，运脾颗粒各剂量组大鼠胃排空率及小肠推进率的差异无统计学意义。

2.3 各组大鼠胃窦、结肠组织中SP mRNA表达水平比较 见表2。与空白组比较，模型组大鼠结肠组织SP mRNA的表达水平下调，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，运脾颗粒各剂量组及多潘立酮组大鼠结肠组织SP mRNA表达水平上调，运脾颗粒中、高剂量组大鼠胃窦组织SP mRNA的表达水平上调，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。与多潘立酮组比较，运脾颗粒中、高剂量组大鼠胃窦及结肠组织SP mRNA表达水平上调，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠胃排空率、小肠推进率比较(x±s) %

表2 各组大鼠胃窦、结肠组织SP mRNA表达水平比较(x±s)

2.4 各组大鼠胃窦、结肠组织中VIP mRNA表达水平比较 见表3。与空白组比较，模型组大鼠胃窦组织VIP mRNA的表达水平上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，运脾颗粒各剂量组及多潘立酮组大鼠胃窦组织VIP mRNA表达水平下调，运脾颗粒中、高剂量组大鼠结肠组织VIP mRNA的表达水平下调，差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。与多潘立酮组比较，运脾颗粒中、高剂量组大鼠胃窦及结肠组织VIP mRNA的表达水平下调，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

FD受神经系统和体液的双重调节，其中作为神经调节重要补充的胃肠激素的分泌调控亦至关重要。胃肠激素作为胃肠运动的重要影响因素，参与到胃肠道动力甚至内脏感觉的调节中，通过对胃肠道某些激素的调节，能够改善胃肠道消化运动功能。胃肠肽是消化道与脑进行信号传递的重要化学物质，这些信号可在脑干迷走复合体发挥作用，从而影响迷走神经信号的传出，最终参与到胃肠运动、摄食以及食欲的调控[10]。有研究显示，FD患者胃黏膜中嗜铬细胞数目增多，同时伴有5-羟色胺含量升高，从而认为胃的高敏感性、消化道动力异常可能与此相关[11]。近年研究显示，不同的胃肠激素对胃肠动力有不同的作用，且同一激素对胃肠道不同部位所起的作用也不尽相同，如某些激素在中枢和外周所起的作用相反[12]。因此本研究深入探究FD及消化道运动与胃肠激素的相关性，以期从FD可能发生的病因病机出发，为FD的诊治提供新的思路。

表3 各组大鼠胃窦、结肠组织VIPmRNA表达水平比较(x±s)

SP是由11个氨基酸组成的一种胃肠肽类，由神经细胞和胃肠道分泌细胞分泌，分布于中枢神经系统(Central nervous system，CNS)与肠神经系统(Enteric nervous system，ENS)，主要生理作用是收缩胃肠道平滑肌及胆囊，舒张血管，促进肠蠕动，参与各种内脏神经反射及胃肠道痛觉传导。有学者研究发现，一方面SP以介质形式参与神经源性炎症反应[13]；另一方面通过与外周T细胞上的受体结合，起到免疫调节的作用。也有学者认为，SP作为一种兴奋性神经递质调控着消化道运动功能，能够促进胃肠蠕动可能与其参与消化间期移行复合运动相关[14]。

VIP由28个氨基酸残基构成，是一种碱性抑制性胃肠肽，亦是一种神经递质，主要分布于胃肠黏膜、CNS及ENS，其主要生理功能是抑制胃肠道平滑肌，抑制胃蠕动、胃排空及胆囊收缩，松弛胃肠道括约肌，促进胰液的分泌。研究显示，肠易激综合征模型大鼠血浆中VIP水平表达提高，抑制了胃肠道动力，使胃肠道收缩不易产生故而出现便秘等胃肠道反应[15]。于涛等[16]对人胃黏膜局部VIP mRNA表达情况的研究表明，在FD亚型餐后不适综合征(PDS)组中VIP mRNA水平表达明显较正常对照组增强。VIP通过与特异性受体结合而舒张胃肠平滑肌，亦或是通过加强一氧化氮(NO)、γ-氨基丁酸的释放来松弛平滑肌。同时VIP在神经系统与免疫系统之间通过双向通讯作用调节局部黏膜免疫体系。

运脾颗粒最初由全国名老中医王自立教授的运脾汤而来，王教授在总结前人经验的基础上，结合自己多年的临床体会，认为脾虚失运、气机升降失常是FD病机的关键所在。针对脾虚失运证，提出“脾以运为健，以运为补”理论，以及确立的“健脾先运脾，运脾必调气”已成为诊治脾胃病的基本思路与治则[17～18]。其基本药物组成为党参、白术、茯苓、仙鹤草、枳壳、佛手、石菖蒲、炒麦芽等。方中党参益气健脾，白术补脾益胃、燥湿和中，仙鹤草补脾肾之虚、亦有强壮之效，茯苓健脾渗湿，四药和而为君，有四君子汤之义；佛手疏肝理气和胃，以防木郁克土，却无耗气伤津之弊；枳壳善理气宽中，行气消胀，与佛手合用增强运脾调气之效；炒麦芽健脾消食、行气消胀；石菖蒲芳香醒脾，化湿和胃。诸药合用，寓补气以助运，调气以健运，兼以肝脾共调，使脾运复健，升降如常，诸病自除。

现代药理研究也证实，党参、白术、枳壳、佛手可加强小鼠肠蠕动，促进胃排空，提高消化能力，增加体质量；炒麦芽促进胃酸、胃蛋白酶分泌，起到助消化的作用；石菖蒲也可促进大鼠胆汁分泌；仙鹤草具有抗炎、抗疲劳作用；茯苓可调节肠道菌群；此外，佛手、石菖蒲对焦虑、抑郁等精神情绪障碍有良好的改善作用[19～24]。

本实验结果显示，运脾颗粒对肝郁脾虚型FD大鼠胃窦及结肠组织中胃肠激素的表达均有调节作用，且表现为多靶点、多部位的调控。可能机制是SP作为一种兴奋性神经递质，能够促进胃肠蠕动；VIP作为一种抑制性神经递质，抑制胃肠道平滑肌，使胃肠蠕动及胃排空减缓，而运脾颗粒通过上调SP mRNA与下调VIP mRNA的表达水平，恢复或增强SP促胃动力作用，减弱VIP抑制胃排空的作用，从而双向调节胃肠激素，恢复胃肠道运动，最终达到治疗FD的目的。

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