新型纳米晶体银锌敷料对大鼠深Ⅱ度烫伤感染创面的疗效

郇科 白博 白晓智 苏菲 陈潇 桑宏勋

[摘要] 目的 研究新型纳米晶体银锌敷料对深Ⅱ度烫伤感染创面的治疗效果。 方法 90只SD雄性大鼠，按随机数字法分为3组，每组各30只。在大鼠背部建立两个面积和深度一致的铜绿假单胞菌感染的深Ⅱ度烫伤创面。换药时A组采用纳米银敷料，B组采用纳米晶体银锌敷料，C组采用普通无菌敷料。伤后第3、6、10、14天，用ELISA法检测组织白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）的浓度，用免疫组化染色法观察B组炎性因子表达情况，并记录各组创面的愈合时间。 结果 伤后第3、6、10、14天，B组大鼠炎性因子IL-1、TNF-α浓度低于A组及C组，随着时间延长呈下降趋势，差异有统计学意义（P < 0.05）。B组IL-10、TGF-β浓度高于A组及C组，随着时间延长呈上升趋势，差异有统计学意义（P < 0.05）。免疫组化染色可见随着治疗时间的延长，B组炎性因子TNF-α表达逐渐减少，IL-10表达逐渐增加。B组大鼠的创面愈合时间短于A组和C组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 新型纳米晶体银锌敷料在对深Ⅱ度烫伤感染創面有较好的抗感染、促愈合效果。

[关键词] 感染创面；炎性因子；抗感染；促愈合；生物活性敷料

[中图分类号] R644 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To study the therapeutic effect of the new nanocrystalline silver-zinc dressing on deep partial-thickness scald burn infection. Methods 90 male SD rats were divided into three groups by random number table， with 30 rats in each group. Two deep partial-thickness scald wounds infected with Pseudomonas aeruginosa were established in the back of rats with consistent area and depth. Group A was treated with nano-silver dressing， group B was treated with nanocrystalline silver-zinc dressing， and group C was treated with ordinary sterile dressings when dressing change. The concentrations of interleukin -1 （IL-1）， tumor necrosis factor alpha （TNF-α）， interleukin -10 （IL-10） and transforming growth factor beta （TGF-β） in the tissues were detected by ELISA at 3， 6， 10 and 14 days after injury. Immunohistochemistry staining was used to observe the expression of inflammatory cytokines in group B， and the wound healing time of each group was recorded. Results At 3， 6， 10 and 14 days after injury， the levels of inflammatory factors IL-1 and TNF-α in group B were lower than those in group A and C， and the trend decreased with time prolonged， with statistically significant difference （P < 0.05）. The concentration of IL-10 and TGF-β in group B was higher than those in group A and C， and the trend increased with time prolonged， with statistically significant difference （P < 0.05）. Immunohistochemical staining was showed that the expression of inflammatory factor TNF-α in group B decreased with the prolongation of treatment time， and the expression of IL-10 increased gradually. The wound healing time of group B was shorter than those of group A and C， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion The new nanocrystalline silver-zinc dressing has a better anti-infection and healing effect on deep partial-thickness scald burn infection.

[Key words] Infection wounds； Inflammatory factors； Anti-infection； Promote healing； Bioactive dressings

烫伤已成为目前意外损伤的常见损伤之一，严重的烫伤机体创伤应激、抵抗力下降，皮肤屏障损伤，局部和全身的免疫反应抑制是导致感染并发症的主要原因[1]，铜绿假单胞菌是烫伤创面感染最常见的致病菌之一[2-3]。目前创面治疗的关键在于预防和治疗创面感染，促进创面愈合[4-5]。伤后全身应用抗生素在创面局部很难达到有效血药浓度，为了预防和治疗创面感染，局部应用抗菌药物已成为首选治疗方法，面对多种可供选择的抗菌敷料和制剂，目前尚无统一的标准[6-7]。本研究在纳米晶体银基础上增加了纳米晶体锌的抗菌促愈合敷料，这是一种新型的复合生物活性敷料；通过研究新型纳米晶体银锌生物活性敷料、纳米银敷料及普通敷料对SD大鼠深Ⅱ度烫伤感染创面的治疗效果，比较炎性因子水平以及伤口愈合时间，为新型抗感染促愈合敷料的应用推广提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及主要材料、仪器来源

选取实验用SD雄性大鼠90只，由空军军医大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK（军）2012-0007]，体质量为230～250 g，健康状况良好，常规条件下单独饲养。铜绿假单胞菌ATCC 27853由空军医大学西京医院检验科提供。旋转切片机购自德国LEICA公司，CX31显微镜及摄像系统购自日本Olympus公司。炎性因子白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自Raybiotech公司，免疫组化TNFα、IL-10抗体试剂购自Abcam公司。纳米银敷料及纳米晶體银锌敷料由北京华钽公司提供。

1.2 制作深Ⅱ度烫伤感染模型及分组

90只大鼠采用乙醚麻醉，在背部两侧用模具、蒸汽烫伤建立两个直径约3 cm的圆形创面，烫伤时间8 s，于伤后24 h皮肤全层病理切片HE染色证实为深Ⅱ度烫伤（表皮细胞核固缩，真皮深层受损，胶原纤维融合，毛囊残留），待创面冷却后在每个创面接种0.3 mL浓度为1×109 CFU/mL的铜绿假单胞菌菌液，然后动物回笼单笼饲养，烫伤感染创面制作完成。将所有大鼠按随机数字表法分为A、B、C组，每组各30只大鼠，常规条件下单笼饲养。A组创面采用纳米银敷料换药，B组创面采用纳米晶体银锌敷料换药，C组采用普通无菌敷料换药，敷料与创面边缘皮肤缝合固定，每3天创面消毒，更换敷料1次。

1.3 评价指标

1.3.1 三组大鼠分别于伤后第3、6、10、14天乙醚麻醉，取创面中央组织1 cm2充分匀浆后，3000 r/min（离心半径8 cm）离心15 min，取上清液200 μL，保存过程中如出现沉淀则再次离心。严格按ELISA试剂盒说明书要求检测炎性因子IL-1、TNFα、IL-10、TGF-β浓度。

1.3.2 免疫组织化学（IHC）染色观察B组大鼠创面组织TNFα、IL-10炎性因子在第3、6、10、14天的表达情况。TNFα阳性反应结果表现为细胞胞浆内呈棕黄色染色，不着色为阴性。IL-10阳性反应结果表现为细胞胞浆内呈棕褐色染色，不着色为阴性。

1.3.3最后以创面上皮化为愈合标准，创面上皮化率>95%认为创面愈合，分别记录三组大鼠创面愈合时间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

伤后1～3 d大鼠创面炎性渗出较多。换药后第3天，B组及A组创面干燥，无渗出；C组创面分泌物多，渗出明显（图1）。大鼠精神状态一般，活动略减少，进食一般。1周后大鼠精神状态基本正常，活动及进食状况良好。

2.2 三组各时间点炎性因子浓度比较

大鼠烫伤后随着换药次数的增加及时间的延长， IL-1、TNF-α在创伤、炎症发展过程中浓度变化呈逐渐下降趋势，IL-10、TGF-β浓度变化呈逐渐上升趋势。伤后第3、6、10、14天，B组IL-1、TNF-α浓度低于A组及C组，IL-10、TGF-β浓度高于A组及C组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 免疫组织化学染色结果

B组免疫组化染色明显可见随着换药次数的增加，治疗时间的延长，TNF-α表达逐渐减少，而IL-10表达逐渐增加。见图3、4（封三）。

2.4 三组大鼠创面愈合时间比较

A、B、C三组创面愈合时间分别为（18.38±1.69）、（16.5±1.2）、（20.63±2.56）d。B组大鼠的创面愈合时间短于A组和C组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3讨论

烫伤后皮肤失去细菌屏障作用，极易引起感染，创面感染的预防和治疗是提髙烫伤治愈率的关键，目前创面的局部抗感染治疗是创面治疗的重点[8]。银的抗菌作用历史悠久，在抗生素发明之前，银在医学上一直有诸多应用[9]。近十几年来，银在烧烫伤、开放性损伤、慢性溃疡等感染创面的治疗方面发挥着重要作用。银离子与微生物内含巯基的酶和蛋白质结合而影响其生理功能，破坏细菌多种重要的膜结构，与DNA结合后阻滞其转录等诸多方面[10-11]。

研究表明，多种含银敷料与纳米银敷料对比研究发现，纳米银敷料在杀菌效果方面较其它敷料更好[12-13]，而纳米晶体银释放的团簇银不同于普通的银离子，因其被氯离子或其他有机物质灭活的速率大大降低，因而不易失活[14-15]。纳米银离子敷料对烫伤耐药菌株具有较好的抗菌效果[16-17]。本实验所采用的新型纳米晶体银锌敷料中所含的团簇银的不断释放稳定的、有效浓度的活性银，具有更为持久的抗菌能力。

锌是人体必须的微量元素，是许多转录因子和酶的协同因子。在促进创面愈合方面，锌的作用已经得到了广泛认识和应用[18-19]。目前临床上应用的主要有含氧化锌（10%～20%）的膏剂以及少部分含锌敷料在局部创面的应用。锌离子通过基质金属蛋白酶的作用加强对坏死组织的清除，促进角质形成细胞的迁移，加速上皮化和组织修复。本实验所采用的新型纳米晶体银锌敷料银离子发挥抗菌作用的同时，引入锌离子促进创面愈合，同时，纳米锌在体内外研究中对多种细菌可产生明显的抑制作用，因此新型生物活性敷料具有抗菌、抗炎、促进组织修复等多种活性功能[19]。

创面的愈合过程伴随炎性反应动态变化过程。炎性因子的浓度高低变化在杀灭感染的病原菌及促进愈合方面发挥着重要作用。创面的炎性反应过程表现在炎症细胞的浸润及炎性因子的释放，IL-1、TNF-α作为重要促炎因子，在创伤、炎症发展过程中呈逐渐下降趋势[20-21]。TNF-α是创伤、感染后机体最早产生的多功能细胞因子之一，由活化的单核巨噬细胞合成分泌，启动炎性反应炎性因子网络，并可刺激单核巨噬细胞合成和分泌IL-1、IL-8等炎症介质，并能协同扩大其生物学效应。IL-10、TGF-β作为重要的抑炎因子，在创伤感染后逐渐呈上升趋势[21-22]。IL-10主要由巨噬细胞和单核细胞产生，是一种有效的单核细胞、巨噬细胞减活化剂，减少单核细胞、巨噬细胞对促炎细胞的合成。在炎症过程中，IL-10抑制促炎因子IL-1、TNF-α以及COX-2的作用产物前列腺素的分泌。还可通过激活巨噬细胞并减少星形胶质细胞的激活，抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的合成和释放，抑制损伤引起的继发炎性反应和细胞因子表达，在烫伤后抗感染、抑制炎性反应方面发挥关键作用。TGF-β几乎分布在所有的组织器官，多项研究表明TGF-β及其信号通路在抑制炎性反应、促愈合方面發挥关键作用[23]。纳米晶体银离子敷料能够抑制炎性因子的表达，减轻炎性反应[24]。

本实验见炎性因子IL-1早期稍上升，后期下降，说明创伤感染早期，炎性反应较强，后期由于治疗干预逐渐下降，纳米晶体银锌敷料组下降幅度最大，说明纳米晶体银锌共同参与发挥抑菌抗炎的效果较好。TNF-α在创伤、炎症发展过程中呈逐渐下降趋势，纳米晶体银锌敷料组下降幅度最大，亦说明抗菌抑制炎性反应效果较好。而炎性因子IL-10、TGF-β均呈逐渐上升趋势，B组纳米晶体银锌敷料组上升幅度最大，由于锌离子能破坏细菌的DNA结构，亦能发挥一定的抗菌作用，因此纳米晶体银锌敷料较纳米银敷料具有更好的抗菌、抑制炎症作用。最后纳米银锌敷料的愈合时间最短，因为敷料中的锌离子促进坏死组织自溶与清除，加速肉芽组织生长和上皮形成，发挥了较好的促愈合、组织修复作用。

本实验采用的新型纳米晶体银锌敷料有较强的抗菌能力，由于敷料中成功引入了锌离子，在抗菌、促进伤口愈合较纳米银敷料有更好的优势。因此，新型纳米晶体银锌敷料在创面感染治疗过程中有较好的抗菌、抗炎及促愈合效果。

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（收稿日期：2017-11-17 本文编辑：李岳泽）