CFW荧光染色法检测疑似真菌感染的临床应用评价

何文婧， 高志琴， 陈 健， 任弘谨， 杨 虹， 蔡 晴， 杨连娟

（上海市皮肤病医院，上海 200050）

荧光染色剂Calcofluor White（CFW）能与真菌细胞壁的纤维素、几丁质和其他含β-1，4-糖苷键的碳水化合物紧密结合[1]，可吸收紫外光，使菌丝和孢子发出明亮的荧光，在荧光显微镜下真菌轮廓与黑暗的背景对比明显。国外实验室早已将荧光显微镜用于真菌性角膜炎等疾病病原真菌的检测[2]，而国内实验室由于早年缺乏荧光显微镜，一直沿用KOH湿片镜检法加真菌培养法来检测真菌。但真菌培养及形态学检测耗时长，传统KOH湿片镜检法假阳性率高，使这2种方法均不能满足临床需要。本研究对疑似真菌感染患者的临床样本同时进行了KOH湿片镜检法、CFW荧光染色法和真菌培养法检测，以评价CFW荧光染色法检测疑似真菌感染的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取上海市皮肤病医院门诊疑似真菌感染患者共155例，其中男79例、女76例，年龄（42.0±17.6）岁。采集腹股沟、指（趾）甲、头、手、足、胸、龟头包皮等部位的样本和白带等。每例样本分别采用KOH湿片镜检法、CFW荧光染色法和真菌培养法检测。在进行真菌培养时，每例样本接种于2管沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（sabouraud dextrose agar，SDA）上，26 ℃培养2～3周。

1.2 试剂

荧光染色剂CFW购自石家庄博洋生物科技有限公司（批号20160613）。溶液A主要由荧光增白剂、氢氧化钾和水组成，高浓度的荧光素与真菌细胞壁的主要成分几丁质相结合，标记荧光。溶液B为复染剂，由伊文思蓝和水组成，复染剂可降低样本组织的背景亮度，增加对比度，使荧光信号更加清晰。10%/20%KOH溶液由KOH和水配制而成。指（趾）甲或角质层较厚的皮屑用20%KOH溶液溶解，其他样本用10%KOH溶液溶解。KOH能溶解临床样本中的角质，使组织透明。

1.3 方法

采集每例患者3份适量样本，分别用于KOH湿片镜检法、CFW荧光染色法、真菌培养法检测。

1.3.1 KOH湿片镜检法 取适量临床样本置于载玻片上，加1滴KOH溶液，盖上盖玻片。放置片刻或在酒精灯火焰上微加热，即在酒精灯火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡、压薄样本。先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列方式等。

1.3.2 CFW荧光染色法 将载有临床样本的载玻片放置在水平操作台上，直接向样本上滴加1滴溶液A，静置1 min，如样本的角质化程度较高，需静置2 min，可适当加热，以不沸腾为度。 滴加溶液B 1滴，静置1 min。 盖上盖玻片，轻轻压盖玻片，用棉签吸去多余的染色剂。将样本置于CX23荧光显微镜（日本Olympus公司）下观察：先用低倍镜找到样本所在位置，再用高倍镜寻找菌丝或孢子等结构加以证实。

1.3.3 真菌培养与鉴定 将临床样本分别接种于含有50 μg/mL氯霉素的SDA和含有500 μg/mL放线菌酮的SDA上，置26 ℃培养箱培养2～3周。丝状真菌通过菌落特征和显微镜下特征鉴定，念珠菌通过转种科马嘉念珠菌显色培养基或用API20CAUX测试板条鉴定。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.0软件进行统计分析。采用χ2检验比较CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法的检测结果，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种方式对不同疾病患者样本的检测结果

155例患者不同部位样本的真菌检测结果显示，CFW荧光染色法阳性率（85.8%）最高，KOH湿片镜检法阳性率（76.1%）次之，二者差异有统计学意义（χ2=14.45，P＜0.05）。真菌培养法阳性率（71.0%）最低。其中，脂溢性皮炎、生殖器念珠菌病、马拉色菌性毛囊炎等患者的皮屑在镜下可见少量或大量孢子，CFW荧光染色法对孢子镜检的阳性率明显高于KOH湿片镜检法；对于手足癣、体股癣和头癣患者，CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法阳性率相当；CFW荧光染色法对甲真菌病患者检测的阳性率（100.0%）稍高于KOH湿片镜检法（89.5%）。见表1。

表1 不同疾病患者3种方法的真菌检测结果[例（%）]

2.2 不同菌种CFW荧光染色法与KOH湿片镜检法阳性率比较

对155例患者皮屑进行真菌培养，其中107例真菌培养阳性并做真菌菌种鉴定。对比不同菌种KOH湿片镜检法与CFW荧光染色法的阳性率，发现2种方法检测皮肤癣菌与非皮肤癣菌真菌的阳性率差异不大，而CFW荧光染色法对酵母的阳性率明显高于KOH湿片镜检法。见表2。

2.3 不同感染部位样本的荧光染色镜下形态

不同感染部位样本的荧光染色镜下形态见图1～6。

图1 甲癣荧光染色镜下形态

图2 花斑糠疹荧光染色镜下形态

图3 足癣荧光染色镜下形态

图4 毛囊炎荧光染色镜下形态

图5 头癣荧光染色镜下形态

图6 毛囊虫荧光染色镜下形态

3 讨论

浅部真菌感染的诊断主要依赖于临床样本的真菌直接镜检和培养[3]。在传统真菌感染的诊断中，KOH湿片镜检法是最简单、最经济的方法，但该法的准确检测需要有经验的检验工作者，降低把细胞壁、纤维误认为菌丝[4-5]，把气泡和油滴误认为孢子的概率才能实现。真菌培养结果与皮屑采集的质量、数量及患者的近期用药情况均息息相关，且耗时长。在本研究中，真菌培养法在真菌性疾病的诊断中阳性率最低。真菌荧光染色剂CFW为二苯乙烯类化合物，是一种非特异性荧光染料，能够非特异性地结合β-1，3-糖苷键和β-1，4-糖苷键连接的多糖，如几丁质、葡萄糖、纤维素。在荧光显微镜下，发散光和激发光波长在355 nm时，真菌发出明亮的蓝色荧光，而其他成分呈微弱的灰蓝色，是能快速检测真菌的新型染色剂，适用于各种疑似真菌感染的检查，如体股癣、手足癣、头癣、甲癣和花斑糠疹等，也可与各类真菌结合而发出荧光，包括毛癣菌、念珠菌、马拉色菌及曲霉等。本研究在CFW荧光染色法真菌镜检过程中偶见明显的毛囊虫虫体（图6），与周围背景形成鲜明对此，虫体形态结构清晰，由此可见CFW荧光染色法也可用于临床毛囊虫的检查。

KOH溶液使真菌在组织皮屑中更明显，荧光染色剂因结合真菌细胞壁的多糖等成分而使真菌检测更具敏感性和特异性[6-7]，尤其在酵母感染性真菌病的诊断中效果更好。RAMOS等[8]的研究表明马拉色菌分离培养非常困难和低效，但CFW荧光染色法为马拉色菌病提供了一种快速、有效的早期诊断方法。BHAVASAR等[9]研究显示，在众多念珠菌检测方法中CFW荧光染色法更具可靠性和敏感性。

以往的文献已证实荧光染色法在真菌检测中较传统的KOH湿片镜检法具有敏感性强、阳性率高的优点[10-12]。CFW荧光染色法检测浅部真菌病快速、有效、简便，值得在临床推广应用。临床上也可同时结合KOH湿片镜检法和真菌培养法，使真菌检测结果更加直观和准确。

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