超声辅助酶水解-高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱测定贝壳类海产品中砷形态

王继霞， 张 颜， 叶明德*， 陈 帆

(温州大学化学与材料工程学院，浙江温州 325035)

海产品是人类摄取蛋白质的主要来源，也是摄入砷的主要途径之一。砷通过食物链可在人体内累积，对人的心肌、呼吸、生殖、造血、免疫系统产生不同程度的损害作用[1 - 2]。研究表明，自然界中有6种常见的砷形态[3 - 4]，即一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、亚砷酸盐(As(Ⅲ))、砷酸盐(As(V))、砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)，其毒性不仅与元素总量有关，而且与其化学形态有密切的关系。无机砷的毒性远远大于有机砷的毒性，砷化合物的毒性顺序为：As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA>AsC>AsB，而砷胆碱(AsC)和砷甜菜碱(AsB)被认为是无毒的[5 - 6]。

砷形态分析过程中，关键的是提取方法的选择[7]。酶提取法是近年来在砷形态分析研究中使用最广泛的提取方法，常用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K等[8 - 9]。酶提取法能保持样品中砷的初始形态，不会产生其他杂质污染。但酶提取法一般耗时较长，而超声和微波辅助酶提取能在很大程度上缩短提取时间[10 - 11]。本文采用超声辅助胃蛋白酶水解法有效提取贝壳类海产品中的砷化合物，并采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG -AFS)分析其中的砷形态。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

SA-10型原子荧光形态分析仪(北京吉天仪器有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；FD-1C-80型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250×4.1 mm i.d.,10 μm)(Agilent仪器有限公司)；超低温冰箱(青岛Hair特种仪器有限公司)；超纯水处理系统。

白蛤、淡菜、溪螺、河蚬、花甲螺、蝾螺、蛏子、血蚶、锥螺、花甲、香螺、海螺12种贝壳类海产品，均采购于浙江省温州市农贸市场。

图1 5种砷形态标准的色谱谱图Fig.1 Chromatograms of arsenic species of five mixed standard

1.2 样品的前处理

称取0.2500 g样品于试管中，加入7.5 mL胃蛋白酶液(称取100 mg胃蛋白酶，溶解于7.5 mL超纯水中，用0.1 mmol/L HCl调节pH至4.5)，在35 ℃的条件下超声5 min，提取液在6 000 r/min的条件下离心20 min，取其上清液，用超纯水稀释至10 mL备用。所有溶液测定前经0.45 μm的水相膜过滤[12 - 13]。

1.3 HPLC-HG -AFS的参数

砷形态分析时HPLC-HG -AFS的实验参数如表1所示，在该条件下得到各砷形态的色谱分离图如图1所示。

表1 砷形态分析HPLC-HG -AFS的实验参数Table 1 The parameters for arsenic speciation by HPLC-HG -AFS

图2 超声辅助胃蛋白酶提取贝壳类海产品中砷形态条件的优化 Fig.2 The optimized conditions of ultrasound-assisted pepsin extraction of arsenic species in shell a:pH;b:The mass of pepsin;c:Time;d:Temperature.

2 结果与讨论

2.1 胃蛋白酶提取条件的优化

采用超声辅助胃蛋白酶水解法提取贝壳类海产品中的砷化合物。由于温度、时间、pH值、酶的质量的变化对提取砷化合物产生不同的影响，实验分别研究了不同温度、时间、pH值及酶的质量对超声辅助胃蛋白酶水解提取砷化合物的影响，如图2所示。结果表明，温度为35 ℃，时间为5 min，酶质量为100 mg，pH为4.5时，胃蛋白酶水解提取砷形态的效果最佳。

2.2 分析性能

配制浓度为20、80、160、240 μg/L的混合标准溶液。以质量浓度(x,μg/L)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标作图，得各形态砷在10～300 μg/L的范围内标准曲线线性良好，相关系数在0.9992～0.9999范围内。As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB和As(Ⅴ)的检出限分别为3.51、3.30、3.34、2.36、1.47 μg/L。取80 μg/L混合标准液重复进样6次，得As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB和As(Ⅴ)的相对标准偏差(RSD)分别为2.11%、1.84%、1.04%、2.20%、1.57%。

2.3 贝壳类样品的测定

选择温州的12种贝壳类海产品，按照样品的前处理方法对样品进行处理，采用HPLC-HG -AFS对样品进行砷形态分析。结果如表2所示，表明贝壳类海产品中的砷主要以有机砷的形态存在，也以微量的无机砷的形态存在。

表2 贝壳类样品中砷形态的测定Table 2 The determination results of arsenic species in shell samples

ND:Not detected.

2.4 样品回收率试验

为验证方法的可靠性，采用河岘样品进行加标回收率试验。根据河岘中砷形态的实际值，对As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB、As(Ⅴ)5种砷形态进行加标回收试验，6次重复测定。结果如表3所示，As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB、As(Ⅴ)的平均加标回收率为89.6%～107.1%，表明该方法可行。

表3 河岘样品的平均回收率和RSD(n=6)Table 3 Recovery and RSD of five arsenic species in Asian Clam(n=6)

3 结论

本实验采用超声辅助胃蛋白酶水解法进行海产品中的砷形态进行提取，快速环保、且不引入其它杂质干扰；基于此，建立了HPLC-HG -AFS联用技术测定贝壳类海产品中As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB和As(Ⅴ) 5种砷形态的分析方法。结果表明，该方法简便、快捷，精密度好，满足贝壳类海产中砷形态分析的需求。为贝壳类海产品中砷的形态分析提供了一种可行的分析方法，并为国家食品安全卫生标准的完善提供了依据。

参考文献：

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