宝坻大蒜HPLC化学指纹图谱构建

尚云涛 ，任春雪 ，王宁宁 ，徐李薇 ，范宝莉 ，陈 宏 ，王振英

（1.天津师范大学天津市水资源与水环境重点实验室，天津 300387；2.天津师范大学生命科学学院，天津300387；3.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

大蒜（Allium sativum L.）属百合科（Liliaceae）葱属（Allium）2年生草本植物，在我国已有超过2000年的栽培历史，我国也是当前大蒜种植面积及产量最多的国家之一.现代医学研究表明，大蒜具有抗氧化、防癌、保肝、增强机体免疫力以及降低心脑血管疾病发生风险等功效[1-2].大蒜提取物也被广泛应用于畜牧业、水产养殖业的动物疾病防治以及农产品贮藏保鲜等领域[3-4].大蒜富含对人体有益的蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素、锌、铁、硒等多种微量元素、多种含硫化合物如蒜氨酸以及次级产物大蒜素等[5].

化学指纹图谱是在DNA指纹图谱概念基础上发展起来的，目前主要用于中药材的种属鉴定、植物分类研究和产品品质管理等.高效液相色谱技术（HPLC）是出现最早、也是当前应用最为广泛的化学指纹图谱分析方法[6].如李婷婷等[7]建立了黄芪的HPLC指纹图谱，共确定15个共有峰，样品相似度在0.9以上，并对黄酮类成分的含量进行了定量分析.张茹萍等[8]建立了雷公藤药材的HPLC指纹图谱，并利用主成分分析法评价了不同产地雷公藤的药材质量.冯旭等[9]利用HPLC技术建立了不同品种芒果叶片水提取物的HPLC指纹图谱，共确定9个共有峰，并根据聚类分析结果将31个品种芒果分为3大类.近年来，有研究者建立了大蒜的HPLC指纹图谱并应用于大蒜及其制剂质量控制[10-11]，结果证实指纹图谱技术方法稳定、可靠、重现性好，可以很好地评价、控制大蒜及其制剂质量.目前报道所涉及的大蒜产地主要有新疆、山东、河南、云南、甘肃、辽宁等地区，缺乏天津宝坻大蒜的数据.天津宝坻大蒜“六瓣红”作为国家地理标志性特色农作物，特色鲜明，如蒜皮多为紫红色，蒜头通常4或6瓣，单柱型围座，无加楔，无重瓣，致密坚硬，具有成熟早、耐寒、耐干旱、耐贮藏等优良农艺性状.宝坻大蒜蒜瓣洁白脆嫩、风味浓郁、辛辣多汁、口感极佳，蒜瓣捣烂后粘稠度高，不易变质，是重要的天然植物粘合剂[12]，深受国内外消费者青睐.因此许多外地大蒜因形似而冒充宝坻大蒜，以次充好，扰乱了市场秩序.

本研究利用高效液相色谱技术，构建天津宝坻大蒜的HPLC化学指纹图谱，为宝坻大蒜“六瓣红”的质量控制和评价提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：宝坻“六瓣红”大蒜，采自天津宝坻区大蒜种植基地.

试剂：二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚对照品，美国Sigma试剂公司；甲醇（色谱纯），德国Merck公司；C18固相萃取小柱（500 mg，3 mL），美国Supelco公司.其余试剂均为分析纯.

1.2 仪器

1200型高效液相色谱仪（配有二元泵、在线真空脱气系统、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Chem Station工作站），美国Agilent公司；固相萃取仪，美国Supelco公司.

1.3 色谱体系

Eclipse Plus C18，5 μm，4.6 mm × 250 mm.保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5 μm；4.6 mm ×12.5 mm，柱温35℃，流动相为甲醇-体积分数为0.2%的甲酸水溶液（体积比为4∶1），流速为1 mL/min，DAD检测波长为240 nm，进样量为50 μL，检测时间20 min.

1.4 对照品制备

准确称取二烯丙基二硫醚30.44 mg和二烯丙基三硫醚32.12 mg，溶于甲醇中定容至50 mL，再吸取上述混合溶液1 mL，用甲醇定容至10 mL作为对照品.

1.5 供试品溶液制备

称取大蒜鳞茎20 g，破碎、研磨，加入25～30 mL蒸馏水，50～55℃温浴酶解1 h，加甲醇定容至50 mL，5 000 r/min离心15 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为待测溶液.C18固相萃取小柱经5 mL甲醇、10 mL超纯水活化后，平衡15 min.将待测溶液以4 mL/min的速率过柱，再用5 mL超纯水淋洗，低真空（-60 kPa）抽干；再由5 mL甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5～0.8 mL，再以甲醇定容至1 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液.

1.6 样品测定

按1.5方法制备10批次宝坻“六瓣红”大蒜供试品溶液，按1.3色谱体系进行测定，记录色谱图.

1.7 数据处理与分析

采用国家药典委员会编写的《中药色谱指纹图谱相似度系统2004A》软件对数据进行分析.

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度分析

取同一批次宝坻“六瓣红”大蒜供试品溶液，按1.3色谱体系连续进样5次，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表1和表2所示.由表1和表2可以看出，宝坻大蒜高效液相色谱分析共得到14个色谱峰，5次进样所有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于1.0%，符合国家标准（RSD＜3.0%），表明仪器精密度良好，符合化学指纹图谱的精密度要求.

表1 精密度实验结果（保留时间）Tab.1 Results of precision experiment（retention time）min

表2 精密度实验结果（峰面积）Tab.2 Results of precision experiment（peak area）mAU·min

2.1.2 稳定性分析

取同一批次宝坻“六瓣红”大蒜供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按第1.3节色谱体系连续进样检测，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果如表3和表4所示.由表3和表4可以看出，在连续24 h的进样检测中，14个色谱峰的相对保留时间RSD最大值为1.04%，相对峰面积的RSD最大值为1.48%，均小于2.0%.表明宝坻大蒜样品溶液在24 h内稳定性良好.

表3 稳定性实验结果（保留时间）Tab.3 Results of stability experiment（retention time）min

表4 稳定性实验结果（峰面积）Tab.4 Results of stability experiment（peak area）mAU·min

2.1.3 重复性实验

取同一批次宝坻“六瓣红”大蒜制备成5份供试品溶液，按第1.3节色谱体系连续进样检测，考察色谱峰的保留时间和峰面积，结果如表5和表6所示.由表5和表6可以看出，各色谱峰的保留时间RSD最大值为0.89%，峰面积RSD最大值为1.50%，均小于2.0%，表明体系的重复性良好，符合指纹图谱的技术性要求.

表5 重复性实验结果（保留时间）Tab.5 Results of repetitive experiment（retention time）min

表6 重复性实验结果（峰面积）Tab.6 Results of repetitive experiment（peak area）mAU·min

2.2 宝坻“六瓣红”大蒜HPLC指纹图谱的特征峰

根据不同批次宝坻“六瓣红”大蒜样品的HPLC图谱数据，采用药典委员会编写的《中药色谱指纹图谱相似度系统2004A》软件，生成的共有模式对照指纹图谱如图1所示，10批次大蒜样品的化学指纹图谱如图2所示，对照品色谱峰如图3所示.

图1 宝坻大蒜HPLC对照指纹图谱Fig.1 Control HPLC chromatogram of Baodi garlic

图2 宝坻“六瓣红”大蒜样品指纹图谱Fig.2 Overlapped HPLC fingerprint chromatogram of ten batches of Baodi garlic samples

图3 对照品色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of control substance

对10批次宝坻“六瓣红”大蒜的HPLC指纹图谱检测结果进行分析，共确定14个共有峰，其保留时间分别为：2.243、2.991、3.423、3.871、4.731、5.993、6.629、7.168、8.151、9.295、10.824、13.344、15.650、18.723 min，共有峰占总峰面积的90%以上，经过与对照品进行比较，第10、12号峰分别鉴定为二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚.选择第10号峰（二烯丙基二硫醚）为内参比峰.由图2可以看出，10批次样品化学指纹图谱的相似度极高，且与对照指纹图谱相似.

2.3 宝坻大蒜HPLC指纹图谱的相似度评价

分别根据《中药色谱指纹图谱相似度系统2004A》软件和夹角余弦法计算不同批次宝坻“六瓣红”大蒜样品相似度，结果如表7和表8所示.由表7和表8可以看出，根据软件和夹角余弦法计算的10批次宝坻大蒜样品相似度良好，均大于0.99，符合指纹图谱的的要求，可建立共有模式[13].

表7 10批次宝坻“六瓣红”大蒜HPLC指纹图谱相似度计算结果Tab.7 Similarity of the HPLC fingerprint of ten batches of the Baodi garlic

表8 10批次宝坻“六瓣红”大蒜HPLC指纹图谱夹角余弦法相似度计算结果Tab.8 Similarity of the HPLC fingerprint of ten batches of the Baodi garlic using Cosine method

3 结论

为了有效评价、控制宝坻大蒜的质量，科学鉴别宝坻大蒜，本研究采用高效液相色谱法并利用固相萃取技术对样品进行纯化，纯化后样品峰型与分离度都得到明显改善，所获得的宝坻大蒜指纹图谱满足要求.通过与对照品保留时间比对，确定了大蒜中2种重要含硫化合物二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚的保留时间，并以二烯丙基二硫醚为内参比峰.采用夹角余弦法计算相似度并与《中药色谱指纹图谱相似度系统2004A》软件计算结果进行比较，结果表明2种计算结果较为一致，样品相似度良好.利用HPLC技术对比研究了不同批次宝坻“六瓣红”大蒜样品，确定了14个共有峰，建立了宝坻“六瓣红”大蒜HPLC化学指纹图谱.该方法为宝坻“六瓣红”大蒜化学成分分析提供了理论依据，为科学、全面评价宝坻“六瓣红”大蒜品质及新品种培育提供了可靠的检测方法.

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