双向电泳在植物蛋白质组中的应用

郭昆

随着人类基因组计划与10余种模式生物基因组全序列测定的完成， 基因组计划的重心已逐渐由结构基因组研究转移到功能基因组研究，生命科学随之开始了一个新的纪元—后基因组时代， 蛋白质组研究则应运而生。1975年，OFarrell和Klose首先建立了等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE）分离和分析蛋白质组分的技术。该技术的应用，使得多组分，低浓度蛋白的分离成为现实。

1 双向电泳样品制备技术

样品制备是双向凝胶电泳成功的关键， 直接影响到蛋白质组研究结果。其一般过程是：对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原， 断开蛋白质之间的连接键， 提取全部蛋白质， 除去非蛋白质部分。但溶解度差的蛋白质， 如膜蛋白、与膜相连的蛋白质以及来自具有高抗性组织的蛋白质， 需要添加离析剂、表面活性剂、两性电解质和还原剂等以增加蛋白质的溶解度， 提高蛋白质的提取率。目前常用的离析剂有尿素和硫脉， 尿素是双向电泳制备时最常用的变性剂， 硫脉则可以帮助许多难溶的蛋白质进行溶解；表面活性剂可消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性，常用的非离子型去垢剂有CHAPS、CHAPSO、SB3-10和ASB-14等。在變性剂和表面活性剂联用条件下，再加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底，常用还原剂为含自由巯基的DTT以及不带电荷的TBP。

王丽娟分别采用TCA-丙酮沉淀法和尿素一硫脲法提取菜籽种子蛋白，用Bradford法对所获得的样品进行蛋白定量后，发现尿素一硫脲法提取的蛋白质所得2-DE图谱较模糊，低丰度蛋白质点数较少，横竖纹干扰较大，分辨率较低；而TCA.丙酮沉淀法提取的蛋白质所得2-DE图谱蛋白质点聚合较好，低丰度蛋白分离较好，蛋白点数显著多于尿素一硫脲法，且蛋白点分布均匀，图谱质量较好。张燕等对甘蔗蛋白质组双向电泳技术优化结果，发现不同裂解液对蛋白质干粉的溶解能力存在明显差异。

2 双向电泳在植物蛋白质组中的应用

2.1 利用双向电泳建立蛋白质组图谱

利用双向电泳的高分辨率和高重复性，建立不同物种植物的蛋白质组图谱，尤其是对已经测序植物图谱建立，可以更好的研究基因的功能，表达后的修饰等方面的研究提供有力的证据。植物的逆境胁迫可以是非生物胁迫的（abiotic） ， 即由过度或不足的物理或化学条件引发； 或者是生物的（biotic） ， 即由其他生物如病原菌所施加。通过对不同逆境胁迫下蛋白质组图谱的建立可以在植物应答非生物胁迫包括盐胁迫、温度胁迫、干旱胁迫、氧胁迫、金属离子胁迫和机械伤害等， 和生物胁迫， 如病菌侵害的蛋白质组学研究上提供一些借鉴。对于植物不同发育阶段电泳图谱的建立可以在不同时间和空间上了解植物发育过程中蛋白质是否表达和表达量的变化，更好的为植物不同阶段发育的研究提供一种有效的方法。

2.2 差异蛋白质组学的研究

差异蛋白质组学，主要是筛选和鉴定不同种类或状态下各样本之间蛋白质组的区别与变化，实现对体系内代谢调控的动态监测，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，从而揭示机体对内外界环境变化产生反应的本质规律与基因组的稳定性相比，蛋白质则具有可变、多样的特点，即使同一细胞，在不同生理或病理环境中，其蛋白表达也是不同的。蛋白质组的这种特点参与和影响着整个生命过程，这为差异蛋白质组的出现与兴起奠定了逻辑基础，差异蛋白质学研究的理论假设是承认某一细胞或组织在发生某种正常或异常变化时，其蛋白质组会发生相应的、有规律的改变。如能对此类蛋白进行验证，进一步证明其与该变化密切相关，则可认为差异蛋白是这种变化的一类标志性蛋白。差异蛋白质组学研究由于并不要求捕获“全部”蛋白，而重在找出有意义的差异蛋白，因而有着高得多的可实现性。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。因此，它对园艺植物的发育和组织器官分化、突变体、对生物和非生物胁迫的适应机制、生理生化过程以及亚细胞结构研究等方面均有着重要的理论与实践意义。

2.3 对于新蛋白的快速鉴定和分离

转录水平并不能完全反映基因表达，蛋白质是生命活动的承载者，也是大多数基因功能最终的呈现形式。因此，从转录水平上所获取的有关基因表达的信息并不足以揭示该基因在细胞内的具体功能，还需要从蛋白质组方面进行深入研究，利用蛋白质组技术寻找与基因相关的蛋白质，进而通过数据库查询找到相应的基因，具有重要的理论和实践意义。双向电泳技术可以快速的鉴定低峰度蛋白，通过双向电泳与质谱技术联用，可以快速鉴定出电泳图谱中各个点的蛋白质序列。再通过生物信息学手段，对鉴定蛋白在蛋白质数据库中进行比对，就可以找到未鉴定过的蛋白。依据这种分离鉴定以及计算机技术的联合应用，可以建立一种高效的、快速的蛋白质分离鉴定方法。对于低峰度蛋白表达的检测和鉴定，具有重要意义。利用该技术可以进一步研究生物不同条件下代谢途径，进而建立一种生物系统学的研究方法。

3 展望

蛋白质组学是一门新兴的学科，虽然刚刚起步，但却为大规模地直接研究基因功能提供了强有力的工具。目前，蛋白质组学在植物研究的多个领域得到初步应用。双向电泳技术的建立和改进，使得蛋白质组学在基因功能研究、低丰度蛋白的研究和分子系统学的研究中起了重要作用。综上所述， 将蛋白质组技术用于生物研究必将会促进未来生命科学的整体发展，而双向电泳技术则是蛋白质组发展的有力促进剂。