不同精粗比率日粮对山羊瓣胃上皮细胞增殖的影响

卢劲晔，赵怀宝，顾蓓蓓，冯 晴，张 磊，许 君，沈赞明

（1.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；3.连云港东海县动物卫生监督所，江苏 连云港 222300）

反刍动物的胃是复胃，由四个胃室组成，分别是瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。其中，瓣胃为第三个胃室，主要起“筛网作用”，进入瓣胃的大颗粒食物在瓣胃肌肉的收缩下被研磨成细小的颗粒。瓣胃是反刍动物特有的、主要的消化和吸收器官之一。研究发现，提高精料饲喂比率后，瘤胃重量提高，而瓣胃重量下降[1]。前期的研究主要集中在提高精料比率后对瘤胃上皮细胞增殖的促进作用，而对瓣胃重量的下降并未进行深入探索，而目前与此相关的报道也很少，并且主要集中在表观指标的测定，对其机理并未进行阐述和分析。本试验拟进一步研究不同精粗比日粮对瓣胃上皮生长的影响及其机理。

1 试验设计

1.1 动物饲养

试验动物选用健康青年波杂山羊24只（90～120日龄）。试验开始前适应2周时间，期间对山羊进行驱虫，山羊自由采食及饮水，逐渐增加精料饲喂量至400 g·d-1。试验开始后，根据体重相近及公母对半原则，随机分为纯粗料（PS组，n=8）、粗料加低精料（PSLC组，n=8）和粗料加高精料组（PSHC组，n=8）。试验期间自由饮水及采食花生杆；PSLC组饲喂精料200 g·d-1，PSHC组饲喂精料400 g·d-1，饲喂持续42 d，第43 d屠宰取样，饲粮营养水平见表1。

表1 饲粮营养水平 DM

1.2 样品采集

山羊屠宰后取瓣胃，去除内容物并清洗后称重，并剪取适量瓣胃叶片，用预冷的PBS（pH7.4）反复冲洗，再用吸水纸擦干，部分样品用10%福尔马林溶液固定，部分样品置于液氮保存。

1.3 血清EGF浓度测定

无菌采血，ELISA试剂盒测定血清EGF浓度，EGF ELISA Kit购自R&D Systems公司。

1.4 瓣胃上皮细胞培养

采取新鲜瓣胃叶片，刷洗干净，剪取约0.5 g组织，用加入4倍双抗D-Hanks液漂洗3次，用胰酶水浴消化20 min后弃去上清液，重复3次。再将剩余组织放入无菌烧杯中，4倍双抗D-Hanks液漂洗3次后，继续采用胰酶消化，每10 min收集1次消化液。收集的消化液用小牛血清终止消化，并离心得到细胞沉淀。细胞沉淀加入DMEM培养液混匀，调整细胞密度为106个·mL-1，接种于24孔细胞培养板，置于CO2培养箱中培养24 h。

细胞贴壁后分为3组，每组6孔重复。试验组：培养细胞孔中加入终浓度30和60 ng·mL-1的EGF；对照组：加入等量的DMEM培养液。8 h后收集细胞，PBS（pH7.4）洗涤3次后用75%酒精固定。

1.5 流式细胞分析

将75%酒精固定的上皮细胞1 500 r·min-1离心10 min。细胞沉淀用50 μL PBS重悬，再加入500 μL碘化丙啶染液，震荡混匀后置于室温避光染色20 min，再用流式细胞仪检测细胞周期。每个样品计数10 000～12 000个细胞，用ModFit软件分析结果。

2 结果与分析

2.1 不同精粗比率日粮对血清EGF浓度的影响

不同精粗比日粮对山羊血清EGF浓度的影响见图1。

图1 不同精粗比日粮对山羊血清EGF浓度的影响

由图1可知，喂食后3 h，山羊血清EGF浓度均显著提高（P＜0.05）；与PSHC组相比，PS组喂食后3 h山羊的血清EGF浓度较高。

2.2 不同精粗比率日粮对瓣胃重量的影响

不同精粗比日粮对山羊瓣胃重量的影响见图2。由图2可知，PS组瓣胃干重显著高于PSHC组（P＜0.05）。

2.3 EGF对瓣胃上皮细胞增殖的影响

流式细胞仪分析EGF对瓣胃上皮细胞周期的影响见图3、表3。

由表3可知，EGF处理后显著提高S期和G2/M期细胞比率，降低G0和G1期细胞比率。

图2 不同精/粗比日粮对山羊瓣胃重量的影响

图3 流式细胞仪分析EGF对瓣胃上皮细胞周期的影响

表3 EGF对瓣胃上皮细胞周期的影响 %

3 讨论

粗料包括牧草、干草和秸秆等，是反刍动物前胃生长发育的重要养分。研究表明，提高粗料的摄食比率增大山羊瓣胃干重。结果与前人研究一致[3-7]。EGF作为多种细胞分裂促进剂，可促进多种细胞增殖。研究表明，粗料提高瓣胃干重的同时伴随着血清EGF浓度的升高，提示瓣胃的增重可能与EGF有关。

细胞周期指细胞从1次分裂完成开始到下1次分裂结束所经历的全过程[5]。细胞周期可分为G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G（2DNA合成后期）和M（有丝分裂期）4个期。当G1期的细胞停止分裂，则处于静息状态，此期称之为G0期。通过流式细胞术，表明EGF可提高瓣胃上皮细胞S期和G2/M期比率，降低G0/G1期细胞比率，从而加速瓣胃上皮细胞周期运转，促进细胞增殖。

研究结果表明，高粗料比率日粮可提高山羊血清EGF浓度，进而促进瓣胃上皮细胞增殖，加速瓣胃上皮生长。

[参考文献]

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[7] 赵怀宝.日粮粗/精比对山羊瓣胃上皮生长的影响及机理研究[D].南京:南京农业大学,2011.