慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶过表达对大鼠肝星状细胞功能的影响

周 达， 王 晶， 何玲楠， 李梦婷， 孙 超， 陈源文， 范建高

上海交通大学医学院附属新华医院消化内科，上海 200092

脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase，POP，EC 3.4.21.26)是一种能特异性水解短肽中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶，在体内发挥重要生理功能，参与多肽的生成与代谢、调控细胞增殖与分化、调节体内炎症代谢等[1-3]；但是，POP在外周组织中的具体生物学作用仍未知。肝脏中POP活性很高，提示其在肝内生物学功能值得探索[4-6]。同时已有研究[7]发现，POP参与肝内炎症及肝细胞增殖与分化。我们前期实验发现，POP水解胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)产物N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)具有抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)活性和抗肝纤维化作用[8-9]；其他研究人员发现，Tβ4对四氯化碳诱导急性肝毒性有保护作用同时可以抑制HSC活性[10-11]。然而，POP在HSC内具体功能尚不明确。

肝纤维化主要表现肝内炎症及细胞外基质沉积，HSC起至关重要的作用[12-13]。本研究旨在以HSC作为切入点，通过携带POP基因的慢病毒感染HSC-T6，探讨POP在HSC内的生物学功能，进一步阐明POP在肝脏炎症与纤维化发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1细胞培养大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。HSC-T6根据需要以适当密度接种于不同大小培养皿中，培养液为质量浓度为100 g/L的FBS/DMEM培养基(血清及培养基均购自Gibco，USA)，置于含体积分数为5%的CO2孵育箱中，在细胞处于良好生长状态时进行下述相关实验。

1.2携带POP基因的慢病毒感染HSC通过PubMed搜索大鼠POP基因(Prep，NM_031324)，设计携带POP和绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒(POP-virus)及空载病毒(Mock-virus)，并由上海吉凯基因化学技术有限公司合成；选取不同的病毒感染复数(multiplicity of infection，MOI值)1、10、100进行感染预实验，荧光显微镜下观察感染效率，最终将MOI确定为10；接种一定数量HSC-T6至3.5 cm培养皿24 h后，弃去旧培养液，随后参照产品说明书进行感染操作，加入慢病毒或空病毒感染12 h后换液为质量浓度为100 g/L的FBS/DMEM培养基继续培养48～72 h(根据细胞密度决定)，同时设立正常对照组，荧光显微镜下观察感染效率，随后进行各组细胞RNA及蛋白提取及后续实验。

1.3ELISA检测对POP慢病毒组、空病毒组及正常对照组进行细胞内Ac-SDKP测定，采用ELISA测定方法，按试剂盒说明书(购自SPI Bio and CEA，France)进行。Ac-SDKP的终浓度通过各组细胞数目进行校正，计算出每106个细胞中Ac-SDKP的量，以(nmol/L)/106表示。

1.4CCK-8细胞增殖毒性检测将POP慢病毒、空病毒及正常的HSC-T6以相同数量接种于96孔板中共培养24 h 和48 h，每孔加入200 μl培养液，每孔加入100 μl新鲜培养液，同时设立空白对照组，再加入10 μl CCK-8试剂，避光37 ℃孵育2 h，随后通过酶标仪(uQuant，Biotek，USA)测定每孔在450 nm处吸光度值(OD值)。各孔OD值均需先减去空白孔OD值后分析各组HSC-T6的增殖生长差异。

1.5细胞凋亡检测将感染慢病毒、空病毒及正常的HSC-T6以相同数量接种于3.5 cm培养皿中培养24 h，使用不含EDTA的胰酶(购自GIBCO，USA)消化提取细胞，然后通过流式细胞学检测HSC-T6凋亡，具体步骤参照Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒(Becton-Dickinson，USA)。

1.6实时定量PCR检测对POP慢病毒组、空病毒组及正常对照组进行HSC细胞内RNA提取，采用Trizol法(Trizol购自Takara)测定各组提取的RNA浓度及纯度，通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA(primescriptRTmaster mix购自Takara)，进而利用cDNA进行荧光定量实时定量PCR(SYBR Premix Ex Taq购自Takara，仪器为Biosystems 7500 Real-time PCR system)检测POP、转化生长因子-β1(TGF-β1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、Ⅰ型胶原(Col I)相关基因mRNA表达量，各基因设置3个复孔，各基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(见表1)，最终结果使用相对表达量RQ值(2-ΔΔCt)表示，具体操作步骤参考实际说明书。

1.7Westernblotting检测提取POP慢病毒组、空病毒组及正常对照组细胞内蛋白，采用BCA法测定各组蛋白浓度(BCA试剂购自碧云天生物技术有限公司)。随后进行SDS-PAGE电泳，转膜，质量浓度为50 g/L的BSA封闭2 h，各相关蛋白一抗孵育(4 ℃过夜)，1×TBST洗膜10～15 min×3次，二抗孵育1～2 h，1×TBST洗膜10～15 min×3次，最后使用辣根过氧化物酶法检测(购自Millipore Corporation，Billerica，USA)，使用Image Lab分析蛋白显影条带。POP、TGF-β1、α-SMA三者抗体均购自Sigma-Aldrich公司，p-Smad2/3抗体购自巴傲得生物科技有限公司，Smad7、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，相关二抗及Western blotting相关其他试剂购自碧云天生物技术有限公司，具体步骤参考相关试剂说明书。

表1 Real-time-PCR引物序列Tab 1 Sequence of primers of Real-time-PCR

注：*:Prep为POP的基因名称。

2 结果

2.1慢病毒感染效率48～72 h后进行荧光显微镜下GFP检测，慢病毒及空病毒感染效率均95%以上(见图1A)，为进一步检测病毒感染HSC效率，检测HSC内POP的基因及蛋白表达量，慢病毒组POP mRNA和蛋白表达较空病毒组及正常对照组显著升高(见图1B～1C)。

2.2POP慢病毒感染对HSC内Ac-SDKP水平的影响POP慢病毒组细胞内Ac-SDKP较正常对照组及空病毒组显著升高约50%(P<0.05)，空病毒组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图2A)。

注：con：正常对照组;mock：空病毒组;prep：POP慢病毒组。*P<0.05;**P<0.01。

CCK-8检测发现，慢病毒组细胞在24 h及48 h均较正常对照组增殖生长快，在48 h时较空病毒组多增殖约50%，而空病毒组与正常对照组细胞增殖比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图2B)。不同组别HSC-T6相同条件下培养24 h后，HSC-T6凋亡比例虽较其他两组稍低，但差异无统计学意义(P>0.05)(见图2C)。

2.4POP慢病毒感染对细胞炎症与纤维化基因mRNA和蛋白表达的影响POP慢病毒组MCP-1及α-SMA mRNA表达均较正常对照组显著下降，TGF-β1和Col I mRNA表达各组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图3)。POP病毒组α-SMA蛋白表达较正常对照组显著下调，而Smad7、PPAR-γ蛋白表达较正常对照组显著上调，TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表达在各组间差异无统计学意义(P>0.05)(见图4)。

注：con：正常对照组；mock;空病毒组；prep;POP慢病毒组。*P<0.05，**P<0.01，NS：无差异。

注：con：正常对照组；mock：空病毒组；prep：POP慢病毒组。*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

本研究利用携带POP基因的慢病毒感染HSC，发现POP可抑制HSC分泌炎性因子MCP-1及α-SMA的表达，并可能通过上调Smad7、PPAR-γ的表达抑制HSC的活化，从而具有抗纤维化的作用。

从HSC-T6表达荧光蛋白、胞内POP基因转录水平及蛋白表达均提示POP慢病毒感染成功，且在细胞内稳定表达POP；同时测定各组HSC-T6胞内Ac-SDKP水平变化，提示细胞内表达的POP存在活性；Ac-SDKP为POP水解Tβ4的产物[14]，具有抗多种器官纤维化作用[8-9,15-16]。本课题组[9]在前期工作中已探索Ac-SDKP抗CCl4诱导肝纤维化的机制，主要为抑制TGF-β1和p-Smad2/3的表达，同时抑制HSC的增殖生长，对Smad7表达无影响。本研究发现，POP对TGF-β1和p-Samd2/3表达无影响，而是促进Smad7表达，而Smad7为TGF-Smad信号通路抑制蛋白，具有抗纤维化作用。同时研究发现，POP明显促进HSC-T6的增殖，与Ac-SDKP作用相反；通过本研究可以推断水解酶活性仅是POP一小部分功能，POP更重要的功能在于与其他蛋白结合的协同作用，调控基因转录和细胞生长，这种非酶解功能在中枢系统中研究较多[17-19]，在肝脏系统中研究甚少，值得我们进一步深入研究。此外，POP抑制α-SMA和MCP-1的表达，α-SMA为活化HSC的标志，MCP-1为HSC分泌的主要促炎促纤维化因子[20]，与前期Ac-SDKP作用结果一致。值得一提的是，POP与其下游产物Ac-SDKP在抗肝纤维化效应的具体作用仍不能完全区分，目前缺乏有效方法可以将Ac-SDKP抑制。

我们还发现，POP的HSC-T6胞内PPAR-γ表达显著升高，后者最早被认为是重要成脂基因之一[21]，后越来越多证据证实其为HSC活化和表型转化的关键因子，在维持HSC保持静止状态发挥重要作用，可以抑制α-SMA和TGF-β1等表达，是抑制肝脏炎症纤维化重要因子[22-23]。另有研究[24-26]发现，PPAR-γ可以阻断TGF-β信号通路及抑制Smad蛋白依赖的启动子发挥作用，直接拮抗Smad3在成纤维细胞中的作用，但是不减少Smad3的蛋白表达也不增加Smad7的表达。HSC另外一个特点是储存维生素A类物质，随着其活化，这种物质会逐渐减少直至消失，尽管这种现象与HSC活化、疾病进展关系未完全阐明[27-29]。PPAR-γ可以使HSC恢复这种聚类维生素A物质功能，同时减轻胰岛素抵抗、脂肪性肝炎[23]，同时我们课题组在近期的研究工作中发现，POP通过调控肝细胞内脂质代谢合成基因抑制肝细胞内脂质代谢[30]；进一步结合前面所述POP与HSC增殖的关系，表面上POP促进HSC的增殖可促进纤维化进展，但POP促进HSC增殖的同时也使其从活化状态转变为静止储脂状态，进一步抑制其促纤维化活性[31]。因此，我们推断POP在脂肪性肝炎及其所致纤维化方面也存在重要作用，同时调控HSC活性。

注：con:正常对照组；mock组别:空病毒组；prep:POP慢病毒组。*P<0.05,**P<0.01，NS：无差异。

总之，本研究证实了POP蛋白酶在HSC中生物学功能显著，反映其可能具备肝内抗炎、抗纤维化作用，仍需进一步体内实验验证。但是肝脏系统复杂，本研究仅针对HSC，POP肝内具体功能仍存在许多未解之谜，尤其它的非酶解功能，值得进一步深入挖掘探索，可能为肝脏疾病提供新的诊疗切入点。

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