PRR11对肝内胆管细胞癌患者预后的影响

宋宗昌，郭春亮，唐家宏，朱 璐，申品颖，张 红，韩怀忠，赵鹏飞

解放军第一五五中心医院肿瘤科/开封市血液病学重点实验室，河南 开封 475003

肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一，也是肝脏第二常见原发恶性肿瘤，约占全部肝脏原发肿瘤的10%，多数患者预后很差[1-2]。近年来，ICC发病率和死亡率有逐渐增高的趋势，我国ICC的发病率占全球的一半以上 。ICC的治疗方法仍以手术切除为主，由于我国人民的健康意识淡薄，常规体检及肿瘤筛查工作相对落后，多数患者在确诊时已处于晚期，多数无法进行手术治疗，然而进行R0切除的患者5年生存期为20%～40%,术后复发率高达75%[3]。ICC的发病机制及其发展的重要影响因素尚不明确，探索研究与ICC发生、增殖、浸润及转移相关的重要分子及相关机制有望为其预后判断及临床治疗提供理论基础。

富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11, PRR11)基因是一个新发现的具有癌基因潜能的基因，位于人类染色体17q22区[4]。文献[5]报道，PRR11在一些肿瘤组织，如食管癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌及肺癌等肿瘤组织中高表达，而在其相应癌旁组织中低表达，是患者预后不良的独立因素之一。PRR11与ICC的关系尚不明确，对ICC病理特征及患者临床预后的影响尚未见报道。本研究通过组织芯片及免疫组化方法检测PRR11在ICC及其癌旁组织中的表达情况，并探讨其对ICC临床病理特征的影响及其与ICC患者临床预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2003年1月至2008年12月在解放军第一五五中心医院接受手术治疗并经病理确诊为ICC的67例患者资料，包括癌组织石蜡标本、相应癌旁组织(距肿瘤边界>2 cm，经病理证实无癌组织)石蜡标本、临床病理特征及随访资料(包括年龄、性别、T分期、N分期、TNM分期、分化程度及生存状况)。所有患者术前、术后均未行放、化疗。随访日期截止到2013年12月。所有组织标本的获得均得到患者的同意，签订知情同意书，并得到医院伦理委员会许可。

1.2试剂和方法所有患者组织HE染色玻片均经2位经验丰富的病理学专家鉴定并确诊为ICC。根据报道方法[6]进行组织微阵列构建。从供体蜡块取出1 mm组织柱，放入受体石蜡块中，加热融合。4 μm厚度连续切片贴到3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)预处理的玻片上。S-P法染色：经过脱蜡、脱水、抗原修复、内源性过氧化物酶灭活及I抗孵育、Ⅱ抗结合、显色等过程。抗体稀释按下列方式进行：兔抗人多克隆PRR11抗体(1∶100稀释；美国Sigma-Aldrich公司，HPA023923)，免疫组化染色S-P试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司；KIT-9710)显色。苏木素进行复染。

1.3结果判定PRR11蛋白免疫组化染色结果由2位病理科专家分别在奥林帕斯CX31显微镜下观察(日本Olympus公司)。免疫组化评分标准[7]采用免疫显色强度和阳性细胞密度相结合的方法综合计算：细胞染色强度评分：0分为无染色，1分为弱染色(淡黄色细颗粒)，2分为中染色(棕黄色颗粒)，3分为强染色(褐黄色粗颗粒)。肿瘤细胞阳性率评分：0分为0，1分为0～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为75%～100%。计算公式：两者相乘≤3分为阴性，≥4分为阳性。每张切片选择5个高倍镜视野(400×)，取其均值。

1.4统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。ICC组织与癌旁组织中PRR11蛋白表达差异分析、PRR11蛋白表达与ICC临床病理相关性分析均采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法对生存曲线进行描述，并对PRR11蛋白表达阳性及阴性患者的生存差异进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PRR11蛋白表达情况67例ICC组织中有39例PRR11蛋白表达阳性，阳性率为58.2%，ICC组织中PRR11蛋白表达评分为7.15±3.58；癌旁组织中有8例PRR11蛋白表达阳性，阳性率为11.9%，癌旁组织中PRR11蛋白表达评分为2.28±1.27。ICC组织与癌旁组织中PRR11蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

图1 PRR11在ICC组织及癌旁组织中的表达(400×) A:癌旁组织中PRR11蛋白表达阳性; B：癌旁组织中PRR11蛋白表达阴性；C：ICC组织中PRR11蛋白表达阳性；D：ICC组织中PRR11蛋白表达阴性Fig 1 PRR11 expressions in ICC tissues and adjacent tissues (400×) A: positive expression of PRR11 in adjacent tissues; B: negative expression of PRR11 in adjacent tissues; C: positive expression of PRR11 in ICC tissues; D: negative expression of PRR11 in ICC tissues

2.2PRR11蛋白表达与ICC临床病理特征的相关性分析PRR11蛋白表达阳性与癌组织的局部浸润程度(P=0.001)、区域淋巴结转移(P<0.001)及TNM分期(P=0.009)有显著相关性；而与患者年龄(P=0.085)、性别(P=0.052)及癌组织分化程度(P=0.530)无明显相关性(见表1)。

2.3生存分析利用Kaplan-Meier方法进行生存分析，结果显示，67例ICC患者的中位生存时间为29.4个月，PRR11蛋白阴性表达的ICC患者中位生存时间为41.0个月，PRR11蛋白阳性表达的ICC患者中位生存时间为20.3个月(见图2)。PRR11蛋白阳性表达的ICC患者的预后明显低于阴性表达患者(P=0.002)。

3 讨论

ICC是指原发于肝内胆管上皮的恶性肿瘤，占肝脏原发恶性肿瘤的10%～15%，占胆管癌的5%～10%[8-9]。基于生长模式大体标本分为3种类型：肿块型、管周浸润型及管内生长型[10]。组织病理类型分为：腺癌、鳞癌、腺鳞癌、黏液表皮样癌、未分化癌及类癌等，其中腺癌超过90%[11]。近年来，ICC发病率和死亡率有逐渐升高的趋势。美国每年新发病例约8 000人，我国没有系统统计资料，据文献[1-2]报道，我国ICC的发病率约占全球的55%。目前，ICC治疗仍以手术切除为主，根治性手术切除后5年生存率为8%～47%；行姑息性切除者，3年生存率为11%，5年生存率为0；其他治疗或未治疗者平均生存期为4～6个月[12-14]。ICC早期无明显症状，多数患者在诊断时已失去了手术根治的时机，即使予以放疗、化疗、分子靶向药物及最佳支持治疗等，总体5年存活率仍低于5%[3]。

表1 PRR11蛋白表达与ICC患者临床病理特征的相关性Tab 1 Correlation between expression of PRR11 and clinical pathology feature of ICC patients 比例/%

图2 PRR11蛋白表达与生存时间相关性分析Fig 2 Analysis of correlation between expression of PRR11 and survival time

PRR11基因位于人类染色体17q22区，含有51 211个碱基，包括9个内含子及10个外显子，PRR11蛋白由360个氨基酸序列构成，相对分子量约40 kD[15-16]，包含1个二联核定位信号，2个脯氨酸富集区域和1个锌指结构域(Zinc finger domain, ZFD)。该蛋白的作用靶标可能为膜蛋白、胞质蛋白、转录因子、启动子等与肿瘤产生、增殖、侵袭及转移密切相关的蛋白及基因位点。文献[5]报道，PRR11在一些肿瘤组织如食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌及肺癌等组织中高表达，而在正常组织中低表达，是肿瘤预后不良的因素。

为进一步了解PRR11蛋白表达与ICC的关系，我们收集了67例ICC患者的癌组织标本、癌旁组织标本、相关病理参数资料及相应的临床随访资料，研究了PRR11蛋白在ICC组织及癌旁组织中表达的差异、PRR11蛋白表达与ICC病理参数之间的关系，及其对ICC患者预后的影响。利用免疫组化检测发现，PRR11蛋白在ICC组织中高表达(39例，58.2%)，而在正常癌旁组织中低表达(8例，11.9%)，PRR11蛋白表达上调和ICC患者年龄、性别、癌组织分化程度无相关性，而与肿瘤局部浸润、区域淋巴结转移、TNM分期有显著相关性。我们利用随访资料进行Kaplan-Meier方法生存分析显示，PRR11蛋白高表达ICC患者较PRR11蛋白低表达患者的总生存期短。

上述研究结果说明，PRR11蛋白在ICC组织中高表达，并与癌细胞局部浸润、区域淋巴结转移、TNM分期等病理特征显著相关，PRR11蛋白高表达ICC患者生存期显著短于PRR11蛋白低表达患者。提示PRR11蛋白高表达可能是ICC患者的独立预后因素及ICC进展的标志物，检测其表达水平对于判断ICC患者的预后具有重要的临床实践意义，为靶向ICC中PRR11基因表达过程的治疗提供理论基础。

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