高效液相色谱—串联质谱法测定畜肉组织中四环素及3种β-受体激动剂的研究

郭艳琼 ，张晓光 ，邬 杰 ，邬 阳 ，翟泰宇 ，王建军

（1.包头市农产品质量安全检验检测中心，内蒙古 包头 014010；2.包头市农畜产品质量安全监督管理中心，内蒙古 包头 014010）

β-受体激动剂（β-agonists）是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，俗称瘦肉精，可分为苯酚型（包括沙丁胺醇）、间苯二酚型（包括非诺特罗、特布他林及莱克多巴胺）、苯胺型（包括西马特罗及盐酸克伦特罗）［1］。由于β-受体激动剂具有促进动物肌肉组织增长、减少脂肪沉积、改善肉质、提高饲料转化率、营养再分配［2］、提高瘦肉率等作用，故被作为饲料添加剂广泛应用于畜禽生产中［3］。人体如果摄入含有高浓度瘦肉精的动物组织，将会出现心动过速、肌肉震颤、恶心、眩晕、心悸等中毒症状，长期食用会对人体健康产生极大的危害，甚至危及生命［4］。四环素具有广谱抗生活性，能特异性地与细菌核糖体30 S亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成［5］，对革兰阳性菌及阴性菌、原虫、支原体、螺旋体均有作用。但长期滥用四环素类药物，会导致其在动物性产品内大量残留，不但危害人体的健康，造成肾及肝的损害还极易诱导各种致病菌产生抗药性，不利于对人类及畜禽类各种疾病的治疗［6］。由于实际工作中，四环素和β-受体激动剂常配合使用，故需要同时检测这4种物质。但同时检测3种瘦肉精及四环素的方法鲜有报道。该研究运用高效液相色谱—串联质谱（LC-MS/MS）方法，同时测定畜禽肉中的四环素及β-受体激动剂残留，旨在为大量、快速检测畜肉中这4类物质提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 仪器设备

Sigma 3-18K冷冻离心机、Agilent 1260-6420高效液相色谱—串联质谱仪（LC-MS/MS）、北京优晟UGC-24C氮吹仪。

1.2 试剂和标准品

盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇及四环素标准品纯度均大于99%，购自农业部环境科研监测站，浓度为1 000 μg/mL；异丙醇 （色谱纯，Fisher Scientific），甲醇（色谱纯，Fisher Scientific），甲酸（色谱纯，Fisher Scientific）；所用水均为屈臣氏蒸馏水。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：液相色谱柱为Agilent Eclipse Plus C183.5 μm 2.1 mm×100 mm。流动相为 A：0.1%的甲酸水溶液，B：甲醇。流动相流速为0.5 mL/min，流动相的梯度洗脱条件见表1。柱温箱温度为45 ℃，进样量为 15 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.3.2 质谱条件：质谱离子源为电喷雾式离子源（ESI），扫描方式是正离子模式，检测方法为多反应检测MRM。干燥气温度设为300℃，干燥气流量为13 L/min。多反应检测离子对离子情况见表2。

1.3.3 标准曲线溶液的配制：根据单一标准品在高效液相色谱—串联质谱下的峰面积大小及在畜禽肉中残留量不同，每种标准品配制的曲线浓度也有所不同。4种化合物的标准曲线浓度分别为：四环素配制成浓度为 0.009 0、0.007 2、0.004 2、0.002 7、0.000 9 μg/mL；莱克多巴胺及沙丁胺醇配制浓度为 0.56、0.32、0.16、0.08、0.01 μg/mL；盐酸克伦特罗 配制浓 度为 0.50、0.40、0.30、0.05、0.01 μg/mL。

1.3.4 样品处理：称取已绞碎的肉样2.00g于50mL离心管中，分别加入pH值为5.2的乙酸铵缓冲溶液 （0.2 mol/L）7 mL，β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL，涡旋混匀，摇床避光水浴振荡16 h，水温保持在37℃。

将酶解完全的样品放于室温下并冷却至室温，高速离心，离心条件为 10 min×10 000 r/min，移出上清液置于另一个50 mL的离心管中，将所得上清液以1.5 mL/min的速度通过已用3 mL甲醇及3 mL水活化后的PEP固相萃取小柱，然后用3 mL 10%的甲醇水溶液淋洗，减压抽至干燥。最后用5 mL 5%的氨水甲醇溶液洗脱，并收集洗脱液，氮气下吹干，以0.1%甲酸水+甲醇溶液按40%+60%的比例定容至1.0 mL，供高效液相色谱—串联质谱测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与线性范围

将配制好的混合标准溶液按照浓度由低到高依次上机检测，以各标准溶液浓度为横坐标（x），标准样品定量离子质量色谱峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。由图1可以看出，3种β-受体激动剂莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗及四环素在其各自的标准溶液浓度范围内呈现较好线性关系，且线性相关系数（R2）均大于0.99。

2.2 质谱条件选择

利用电喷雾离子源，首先对单一标液进行全质量数扫描（MS1 Scan），准确找出（质量数+1）+离子峰，以其为母离子进行电子轰击，并对碰撞得到的产物离子进行全扫描（Production），得到碰撞产生的子离子，找到2个峰面积较高的产物离子与母离子组成监测离子对并进行多反应监测（MRM），该监测离子对为该化合物的质谱检测条件。附加毛细管电压对母离子的丰度影响较大，由于电场力和重力的作用，所加电压较小时，重力作用大于电场力作用，会导致母离子无法顺利通过毛细管。所加电压过大时，电场力作用大于重力作用，会使得母离子在经过时速度变慢，与四级杆碰撞加强，造成信号减弱。碰撞能量对产物离子的响应有较大影响，当碰撞能量太大时，母离子会碎裂成为质谱无法检测到的较小碎片离子；当碰撞能量较小会造成母离子不能被打碎完全，故碰撞能量及毛细管电压对化合物的在质谱中的响应有很大影响［7］。分别对毛细管电压从75～140 V，以5 V为梯度进行优化；对碰撞能量从5～50 eV，以5 eV为梯度进行优化，分别得到4种化合物的最优毛细管电压及碰撞能量。质谱扫描图见图2。

表2 化合物MRM参数

图1 4种化合物标准曲线

图2 4种化合物的质谱扫描图

2.3 方法定量限及检出限

以信噪比等于3时的标液浓度为检出限，由此可以推算出莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇的检出限（LOD）为 0.25 μg/kg，四环素的检出限为2.5 μg/kg。以信噪比为10时的标准溶液浓度为定量限，则莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的定量限为0.5 μg/kg，四环素的定量限为5 μg/kg。

2.4 方法回收率及精密度

以空白为本底添加不同浓度的标准，4种化合物的平均回收率为90%～110%，相对标准偏差为10%～15%。

3 结论

禽畜肉中兽药残留严重影响人们的健康，兽药残留的检测已引起了相关部门的高度重视。四环素又经常与莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗等β-受体激动剂配合使用，其残留问题比较普遍［8］。为缩短试验时间，节约试验成本，该试验优化了3种β-受体激动剂莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗及四环素的质谱条件，并建立了同时测定畜肉中这4种化合物的高效液相色谱—串联质谱检测方法。四环素及3种β-受体激动剂以0.1%甲酸水+甲醇溶液为流动相进行检测分析，灵敏度高且分析时间较短，重现性和回收率指标等均可以满足定量检测要求。该方法操作简便、重复性好，灵敏度及精密度均能满足要求，适用于畜肉中沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸克伦特罗及四环素标准物质的同时测定，尤其适合大批量样品的快速准确的定性定量分析，可较好地运用于实际检测工作中。

参考文献：

［1］许志刚，练海贤，李攻科，等.β2-兴奋剂的样品前处理与分析检测方法研究进展［J］.分析测试学报，2011，30（4）：465-472.

［2］李磊，周贻兵，林野，等.超高效液相色谱—质谱法同时测定肉制品中8种β-受体激动剂［J］.贵州师范大学学报（自然科学版），2014，32（2）：99-103.

［3］孙雷，张骊，毕言锋，等.猪肝中β-受体激动剂残留检测能力验证结果分析［J］.中国兽药杂志，2011，45（2）：35-38.

［4］曾绍东，王明月，杨春亮，等.高效液相色谱—质谱法测定猪肉中9种β-受体激动剂残留量［J］.分析仪器，2013（4）：5-11.

［5］江秀红.液相色谱—串联质谱法测定鸭肉中四环素类药物残留［J］.福建畜牧兽医，2015，37（4）：1-2，6.

［6］闫小峰.四环素类抗生素残留检测方法研究进展［J］.中国兽药杂志，2010，44（5）：47-50.

［7］邬阳，郭艳，郭艳琼，等.高效液相色谱—质谱法测定果蔬中氟虫腈等7种农药残留的方法研究［J］.北方农业学报，2017（1）：70-76.

［8］林晓华，李迎月，何洁仪，等.广州部分畜禽肉的激素及抗生素残留状况分析 ［J］.中国公共卫生管理，2010，26（1）：93-95.