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磨牙缺失对幼年大鼠海马CA1区神经元及BDNF、TrkB表达影响的研究

2018-05-03李伯琦刘奕杉周晓慧迪丽努尔阿吉

现代口腔医学杂志 2018年2期
关键词:磨牙阳性细胞海马

李 想 李伯琦 于 璐 刘奕杉 周晓慧 迪丽努尔·阿吉

随着口腔医学的发展,关于口腔功能与脑功能的研究已成为该领域的研究热点之一[1,2]。大量研究结果证实,大鼠的情感、行为、学习记忆和空间辨别等高级神经活动主要由海马CA1区参与完成[3]。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是体内含量最多的神经营养因子,酪氨酸激酶 B受体(tyrosine kinases B receptor,TrkB)是BDNF的特异性受体,BDNF在靶细胞膜上与TrkB受体结合,形成配体-受体复合物,从而参与学习记忆功能[4]。研究显示,大鼠海马中BDNF的表达减少是由于成年小鼠的磨牙缺失或者进软食导致的[5]。但磨牙缺失对幼年大鼠海马CA1区BDNF与其受体TrkB的影响仍缺乏足够的理论依据。本研究通过建立磨牙缺失的幼年大鼠模型,观察大鼠海马CA1区神经细胞结构及BDNF、TrkB表达变化,初步研究关于磨牙缺失对幼年大鼠学习记忆能力影响的神经生化基础,并拟求为后期研究奠定理论基础。

资料和方法

1.实验动物及分组:SPF级健康雄性SD大鼠(4~5周龄)50只,体重50~70g,由新疆医科大学动物实验动物中心提供,动物伦理审查批号(IACUC20150709-05),所有动物在清洁、安静的环境下笼内饲养,自由进食水。

SD大鼠进入实验室适应性饲养1周后,按随机数字表法分成A、B、C、D、E五组,每组10只。A组:正常对照组;B组:3颗磨牙拔除组;C组:6颗磨牙拔除组;D组:9颗磨牙拔除组;E组:12颗磨牙拔除组。

2.主要试剂和仪器:实验过程中的主要试剂如下:一抗:脑源性神经营养因子多克隆抗体、酪氨酸激酶B受体多克隆抗体(武汉三鹰);二抗:山羊抗兔IgG;DAB显色试剂盒;抗体稀释液(北京中杉金桥生物科技有限公司);光学显微镜、显微采片机、石蜡切片机、生物组织自动包埋机(德国莱卡公司);注射水合氯醛(新疆医科大学动物实验室提供)。

3.模型的建立:所有实验动物用水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉。A组不进行牙齿拔除术,B组拔除左侧下颌3颗磨牙,C组拔除左侧上下颌6颗磨牙,D组拔除左侧上下颌及对侧下颌共9颗磨牙,E组拔除双侧12颗磨牙。

实验组大鼠用小号止血钳进行磨牙拔除术,术中尽量完整拔除牙齿,若牙冠折断,则去除龈上可见的牙体组织,消除后牙咬合接触,常规压迫止血,处理术后常规颗粒饲料喂养,自由饮水。

4.标本制备:5组大鼠在干预后8周后,麻醉条件下快速断头,剥离脑组织,在冰冷的金属平台上迅速分离出海马组织。将海马组织标本置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1mol/l,pH=7.4)中固定24小时后,常规石蜡包埋。定位海马典型位置,参照《大鼠脑立体定位图谱》进行连续冠状切片,厚5μm。

5.检测指标和方法:①HE染色观察大鼠海马CA1区神经细胞的改变:从各组大鼠中随机抽取8只大鼠的海马组织切片,每只取5张连续切片进行HE染色,在显微镜下观察海马组织CA1区神经细胞形态及细胞排列。②免疫组化法检测海马CA1区BDNF、TrkB蛋白的表达:从每组大鼠中随机抽取8只海马组织切片,采用亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(ABC法)检测BDNF、TrkB蛋白的表达。每只大鼠5张切片进行高压修复抗原,3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶,兔抗鼠BDNF(1:200)、兔抗鼠TrkB(1:300)4℃孵育过夜,二抗37℃孵育45min,二氨基联苯胺(DAB)显色 3min,苏木素复染,梯度酒精脱水,透明及中性树胶封片。③图像采集及分析:光学显微镜下观察大鼠海马CA1区神经元细胞并摄像。每个样本取3张切片,每张切片各选择5个高倍视野(×400),应用Image-pro-plus6.0图像分析系统测定每个视野免疫反应阳性产物的积分光密度值,以平均光密度值作为大鼠海马CA1区蛋白阳性细胞表达的最终数值。

6.统计学处理:应用SPSS22.0统计软件进行统计分析,实验结果以均数±标准差(±S)做统计描述。多组间比较应用单因素方差分析,且认为P<0.05具有统计学意义。

结 果

1.HE染色观察大鼠海马CA1区神经细胞的改变:HE染色结果显示:A组神经细胞结构清楚,细胞膜完整,核大而圆,染色均匀,呈蓝紫色,细胞排列5~8层分布,构成显著的带状,未见神经元变性,水肿及坏死,细胞形态结构正常。而实验组中发现,B组的海马CA1区细胞组织形态与A组相比较发现无明显改变;C组的海马CA1区组织中发现开始出现细胞膜不完整,部分细胞出现空泡状,细胞核固缩,细胞层数的减少和细胞排列的紊乱;而D、E组的海马组织CA1区则发现细胞核碎裂,细胞层数减少以及细胞排列稀疏、紊乱加剧(图1)。

2.免疫组化法检测海马CA1区BDNF、TrkB蛋白的表达:免疫组化染色结果:阳性细胞为细胞膜及胞质内出现棕黄色颗粒,积分光密度值与免疫阳性细胞产物含量成正比。A、B、C、D、E五组在8周时,随着磨牙缺失数目的增加,大鼠海马CA1区的BDNF、TRKB的表达量呈现降低趋势(图4)。A组BDNF、TrkB蛋白表达量最高(370.0±14.56,367.8±13.99)。与A组相比,B组的BDNF、TrkB蛋白的表达量稍降低,表现为免疫阳性产物的积分光密度值降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。而C、D、E组的BDNF及TrkB蛋白的表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)(图2、3、表1、2)。

图1 大鼠海马CA1区组织结构的变化(HE染色×400)

表1 不同处理组大鼠海马CA1区BDNF、TrkB 阳性细胞 IOD值(±S)

表1 不同处理组大鼠海马CA1区BDNF、TrkB 阳性细胞 IOD值(±S)

组别 n 阳性细胞I O D值B D N F T r k B A组B组C组D组E组F P 8 8 8 8 8--3 7 0.0±1 4.5 6 3 6 2.0±1 2.6 3 3 3 4.9±1 9.6 8 2 5 0.5±1 8.3 2 2 4 1.8±1 1.8 0 1 5 3.1 1 7<0.0 0 1 3 6 7.8±1 3.9 9 3 5 9.4±1 5.5 9 3 3 1.9±1 4.5 7 2 5 2.9±1 1.5 5 2 5 0.7±1 2.4 5 1 6 2.6 7 3<0.0 0 1

图2 各组大鼠海马CA1区BDNF蛋白表达的情况(免疫组织化学染色 ×400)

图3 各组大鼠海马CA1区TrkB蛋白表达的情况(免疫组织化学染色 ×400)

图4 不同处理组大鼠海马CA1区BDNF及TrkB蛋白表达情况

表2 不同处理组幼年大鼠海马CA1区BDNF、TrkB表达水平的比较

讨 论

本课题组[6]在前期已经建立不同磨牙缺失的幼年大鼠模型,并通过行为学实验证实,随着磨牙缺失数目变化,大鼠出现不同程度的认知功能障碍。大鼠的海马区是高级神经活动的重要部位,神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元的缺失与认知功能的衰退密切相关,其大量缺失会导致空间记忆能力的减弱[7,8]。流行病学调查显示牙齿缺失是阿尔茨海默病的危险因素之一[9]。磨牙缺失后口腔咀嚼效率降低甚至丧失,直接影响大脑的血流量和供氧水平,且减弱了大脑前叶区皮质的活跃程度,最终导致海马神经元结构和功能的变化,从而对大脑学习、记忆产生不良影响。与此同时,研究表明BDNF及其受体TrkB在学习和记忆中扮演着关键角色。首先,应激可诱导大脑中枢BDNF及其受体TrkB蛋白水平表达明显下降,进而可引起与焦虑等密切相关的大脑边缘系统结构(如海马、前额叶皮质)萎缩,最终导致抑郁的发生[10,11];其次,在认知功能障碍性疾病中,BDNF及其受体TrkB合成和分泌过程及其功能都受到明显影响[12]。在此基础上,本实验深入研究磨牙缺失对幼年大鼠海马CA1区神经元及BDNF、TrkB蛋白表达的影响。

本实验中利用HE染色法观察对比海马神经细胞组织形态。在6、9、12颗磨牙缺失组(C组、D组、E组)中大鼠海马CA1区神经细胞皆出现严重的病理性改变,而3颗磨牙缺失组(B组)并未发生明显改变,将C组、D组、E组实验结果与正常对照组(A组)对比后,得出结论较多数目的磨牙缺失会造成大鼠海马神经元损伤,此结论与其他学者[7,8]的研究结果一致。观察实验结果可知,海马对磨牙缺失较敏感。在磨牙缺失因素的作用下,一方面海马神经元数量减少、形态异常或功能失调,种种变化直接影响中枢神经递质的合成、释放和信息的传递,从而影响神经系统功能;另一方面磨牙缺失致使发育期的大鼠海马神经组织细胞发生凋亡,神经细胞的凋亡或坏死会导致海马神经元大量丢失。据此分析,海马神经元结构和功能的变化将会造成大鼠空间学习记忆功能的损害[13,14]。实验过程同时采用免疫组化法观察BDNF及其受体TrkB蛋白的表达量。实验得出数据:正常对照组(A组)的表达量最高,随着磨牙缺失数量的增加,BDNF及其受体TrkB蛋白的表达量逐渐减少,而在6、9、12颗磨牙缺失组(C组、D组、E组)中,其表达量的减少尤为显著(P<0.01),这与其他学者的描述[5,15]基本一致。由此可见,磨牙缺失会引起大鼠的咀嚼功能减弱甚至消失,同时对大鼠海马的咀嚼刺激减弱,引起海马神经元萎缩凋亡,导致BDNF及其受体TrkB合成分泌减少。这两种因子的缺乏或功能异常是导致焦虑、学习记忆功能障碍等神经系统疾病的原因之一,研究显示改变小鼠磨牙区长期咀嚼的刺激会增加小鼠焦虑情绪[16]。大鼠海马神经组织形态学上的此种损伤及BDNF、TrkB蛋白表达的变化,与磨牙缺失后大鼠海马区神经组织细胞发生凋亡以及大鼠行为学的变化是一致的[6,14]。

综上所述,本研究发现较多数目的磨牙缺失会对幼年大鼠海马CA1区神经元损伤及BDNF、TrkB蛋白的表达会产生明显的影响,同时也证实了磨牙缺失对脑部物质代谢的影响。这些神经元及BDNF、TrkB蛋白表达的异常可能诱导与学习记忆功能障碍相关的多种神经系统疾病。笔者通过磨牙缺失对幼年大鼠海马组织影响的研究结果发现,磨牙缺失对于情绪和学习记忆能力的影响是显著的。加强磨牙缺失的预防和修复对于人类的焦虑、阿尔兹海默症等神经系统疾病的影响尚未可知,仍需后续研究。

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5 Takeda Y,Oue H,Okada S,et al.Molar loss and powder diet leads to memory deficit and modifies the mRNA expression of brain-derived neurotrophic factor in the hippocampus of adult mice.Bmc Neuroscience,2016,17(1):81.

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