中药材中有机磷农药荧光试纸条的开发△

秦斌，王炳志，闫研，马红圳，杨星星，殷果*

(1.深圳市药品检验研究院，广东 深圳 518057；2.深圳市易瑞生物技术股份有限公司，广东 深圳 518101；)

中药是中华民族宝贵的文化遗产，在人民群众防治疾病、康复保健方面起着重要作用。为了获得可观的产量以及较高的经济效益，中药材在种植过程中经常会过量或不当使用农药，而大部分农药在后续加工处理中难以完全去除[1]。过量的农药残留不仅影响中药产品的质量，降低药材疗效，长期食用更可能导致疾病的发生，甚至诱发癌症[2-4]。目前农药残留的测定方法主要有气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)等，依托相应的前处理方法能够获得较高的灵敏度[5-7]。上述方法所涉及仪器设备成本高，操作复杂，需专业技术人员操作并且不能即刻获得结果，因此限制了其在商检等现场快检中的应用。为了满足现场快速检测的要求，本研究将荧光纳米颗粒进行表面修饰，并与有机磷的特异性抗体进行偶联，研制了有机磷纳米荧光免疫层析快速检测试纸条。与传统的胶体金免疫层析技术相比，该荧光试纸条除操作简单快速和信号稳定外，具有强抗光漂白能力，并且受溶剂影响小[8-11]，适用于有机磷等水溶性较差的目标物的快速检测。

1 仪器与材料

1.1 仪器

便携式荧光检测仪由广州市疾病预防控制中心和深圳市易瑞生物技术股份有限公司共同研制。

1.2 试剂及材料

对硫磷、蝇毒磷、丰索磷等农药标品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；2(CdCl2)·5(H2O)、硼氢化钠、碲粉、TGA(疏基乙酸)、MES(2-吗啉乙磺酸)、NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、BSA(牛血清蛋白)购自上海阿拉丁试剂有限公司；海藻糖、蔗糖、Triton X-100、吐温-20、叠氮钠、Tris(三羟甲基氨基甲烷)购自百灵威科技有限公司；有机磷单克隆、多克隆抗体由深圳市易瑞生物技术股份有限公司提供(其中有机磷单克隆抗体可有效识别多种农药，抗体浓度2.5 mg·mL-1)；羊抗鼠IgG购自华美生物公司；PVC衬板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫购自美国Millipore公司；所有试剂如无特殊说明均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 荧光纳米颗粒的制备

称取0.457 g 2(CdCl2)·5(H2O)至盛有100 mL水的250 mL三颈瓶中，加入0.334 mL TGA，用氢氧化钠(1 mol·L-1)调节溶液pH至11。高速搅拌10 min后加入新配制的NaHTe(由硼氢化钠和碲粉混合后超声制得)水溶液(各物质的量摩尔比为：CdCl2∶TGA∶NaHTe=1∶2.4∶0.6)，加热回流2～8 h制得CdTe，该反应须在氮气保护下进行。随后，称取7.5 g环己烷、2.27 g Triton X-100、1.94 g正辛醇和0.5 mL水于烧瓶中制得W/O型微乳液，加入420 μL CdTe，搅拌5 min后加入120 μL TEOS(硅酸四乙酯)与APS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的混合溶液，搅拌均匀后再加入100 μL浓氨水，室温下避光反应24 h。加入10 mL丙酮终止反应，高速离心10 min，弃上清，用乙醇和水分别洗涤3次，烘干得SiO2包裹的CdTe纳米颗粒(CdTe@SiO2)，用蒸馏水分散纳米颗粒，制成 1.0 mg·mL-1悬浮液备用[8]。

2.2 荧光纳米颗粒-抗体偶联物制备

吸取30 μL荧光纳米颗粒(1 mg·mL-1)加入至300 μL MES(50 mmol·L-1)中，再加入100 μL NHS(10 mg·mL-1)及EDC(10 mg·mL-1)，摇床中震荡混匀30 min。冷冻高速离心，弃去上清液，用500 μL MES(50 mmol·L-1)重悬颗粒，加入适量有机磷单克隆抗体，摇床中震荡1 h。再加入500 μL 5% BSA封闭30 min，冷冻高速离心30 min，弃去上清液，用1 mL MES(50 mmol·L-1)洗涤颗粒三次，最后用300 μL 含2%海藻糖的PB 8.0(10 mmol·L-1)溶液重悬颗粒，置于4 ℃保存备用[12-13]。

2.3 白色微孔制备

用100.0 mmol Tris-HCl pH8.0，2.0%海藻糖，1.0%BSA，0.5% 吐温-20，0.1%叠氮钠作为反应液。将反应液与标记好的荧光纳米颗粒按照5∶1混匀，混匀后按每孔60 μL加入到96孔酶标板内，置于-80 ℃超低温冰箱预冻4 h，再置于冷冻干燥机内冻干，加帽后置于4 ℃干燥间保存备用。

2.4 荧光试纸条的制备

以有机磷多克隆抗体为硝酸纤维素膜上的检测线。将对应的多克隆抗体用含有2%的海藻糖的PB 7.4稀释成2.5 mg·mL-1，将稀释好的抗体用喷膜仪以1.0 μL·cm-1的量，喷涂与硝酸纤维素膜上。将喷好的膜置于37 ℃恒温干燥箱内，烘烤30 min，取出后放于干燥间备用[14-15]。

以羊抗鼠IgG包被的硝酸纤维素膜作为质控线，将羊抗鼠IgG用含有1%的蔗糖的PBS(PH 7.4)稀释成1.5 mg·mL-1，将稀释好的二抗用喷膜仪以1.0 μL·cm-1的量，喷涂与硝酸纤维素膜上，将喷好的膜置于37 ℃恒温干燥箱内。烘烤30 min，取出后放于干燥间备用。

试纸条由PVC衬板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。依次将硝酸纤维素膜，样品垫，结合垫贴于PVC衬板上(样品垫与硝酸纤维素膜重叠约3 mm，吸收垫与硝酸纤维膜重叠约4 mm)粘贴好后切成4 mm宽的试纸条，将制备好的试纸条置于密封袋中，加干燥剂，密封，4 ℃保存。

2.5 样品处理与检测

称取2 g粉碎后的中药样品(灯笼草、三七、枸杞等)加入至50 mL离心管中，加入8 mL提取液(15%丙酮和1M pH 8.0 Tris混合液)，涡旋震荡2 min或摇匀后超声提取2 min，高速离心2 min，离心管中上层液体即为待测液。吸取200 μL待测液加入白色微孔内，吹打数次使微孔内液体混匀，静置5 min后插入试纸条并计时8 min。时间到后可用便携式荧光检测仪读出判定结果或借助紫外灯肉眼判断。

2.6 检测原理与结果判定

若待测液中含有对硫磷、蝇毒磷或丰索磷中的一种或几种，则目标化合物会与白色微孔内的抗体-荧光纳米颗粒偶联物结合，并朝着吸收垫方向移动。当移动至检测线时，被检测线上的单抗所捕获，在紫外灯下呈现出明亮的检测线；未与目标化合物结合的偶联物则会继续向吸收垫方向移动，直至被质控线上的抗鼠IgG捕获，在紫外光照射下可观察到具有红色荧光的质控线。

紫外灯辅助肉眼判读依据：如果有质控线可见检测线不可见，则结果为阴性；如果质控线和检测线同时可见，则结果为阳性；如果质控线不可见，则检测结果无效。

便携式荧光检测仪判读依据：便携式荧光检测仪可对试纸条检测线的荧光强度进行读值，读值≤100则检测结果为阴性(-)，读值>100则检测结果为阳性(+)。

2.7 特异性、灵敏性与适用性

用提取液配制一定浓度的对硫磷、蝇毒磷、丰索磷、甲基对硫磷、三唑磷、喹硫磷、毒死蜱、克百威及异丙威的标准溶液(待测液)，用荧光试纸条检测，评价试纸条的特异性；在空白中药样品枸杞中分别添加不同浓度的对硫磷、蝇毒磷或丰索磷标准物质，参照2.5进行样品处理，用荧光试纸条进行检测，确定试纸条的灵敏性；选取几种不同的阴性农药样本，分别添加对硫磷、蝇毒磷及丰索磷标准物质至试纸条具有清晰的检测线，样品处理后用荧光试纸条进行检测，评价其适用性。

3 结果与分析

3.1 特异性检测结果

配制200、500和2000 ng·mL-1的对硫磷、蝇毒磷、丰索磷、甲基对硫磷、三唑磷、喹硫磷、毒死蜱、克百威及异丙威的标准溶液，分别用荧光试纸条检测，用便携式荧光检测仪进行结果判读，结果如表1所示。

由特异性试验结果可以看出该有机磷荧光试纸条对对硫磷、蝇毒磷和丰索磷能够有效识别，并且具有较高的灵敏度。由于甲基对硫磷和对硫磷结构类似，高浓度的甲基对硫磷可能会造成试纸条的假阳，其他农药对该荧光试纸条无明显干扰。

表1 有机磷荧光试纸条特异性结果 ng·mL-1

3.2 灵敏性检测结果

在中药样品枸杞中分别添加不同浓度的对硫磷、蝇毒磷或丰索磷标准物质，样品经处理后用有机磷荧光试纸条测试，试纸条结果如图1所示，便携式荧光检测仪判读结果如表2所示。

注：从左至右分别为添加0、10、30、50、70和90 ng·g-1图1 枸杞中添加不同浓度对硫磷(A)、蝇毒磷(B)及丰索磷(C)标品的试纸条检测结果

如图1-A所示，样品中对硫磷含量为10 ng·g-1时即可在荧光试纸条上清晰的观察到检测线，此时检测仪结果为阳性，读值在260附近，对硫磷含量增加至30 ng·g-1时试纸条的检测线已具有相当强的荧光，此时检测仪读值在440附近，继续增加对硫磷的含量试纸条的检测线已观察不到明显变化，而检测仪读值升高至550附近；图1-B中蝇毒磷加标量为10 ng·g-1时荧光试纸条上可以观察到较淡的检测线，此时检测仪结果为阳性，读值120附近，样品中蝇毒磷含量增加至50 ng·g-1后试纸条检测线荧光强度的变化趋于平缓；由图1-c则可以看出该荧光试纸条对丰索磷的灵敏性要弱于对硫磷和蝇毒磷，加标至30 ng·g-1时试纸条上才出现较弱的检测线，此时检测仪结果为阳性，读值在130附近。该该有机磷荧光试纸条对对硫磷、蝇毒磷和丰索磷检出限分别为：10、10和 30 ng·g-1。

随着样品中丰索磷含量的增加，对应试纸条的检测线也呈梯度变亮(图1-C)，检测仪的读值(表2)也近似线性的增长，低浓度下试纸条对蝇毒磷的响应也有一定的梯度，该荧光试纸条对样品中单一有机磷农药的定量检测具有潜在的应用价值。

3.3 适用性检测结果

表2 有机磷荧光试纸条灵敏性试验结果

表3 不同药样本的适应性检测结果

不同中药样本的适用性检测结果如表3所示，样品处理后取上清直接检测，操作简单，重复实验结果稳定；与金银花和莲子相比，当归、板蓝根等由于色素较深，造成荧光检测仪阳性读数稍低，但从对硫磷试纸条检测结果的照片(图2)可看到检测线亮度无明显差异，说明该有机磷荧光试纸条对多种中药样本具有良好的适用性。

注：1.灯笼草；2.三七；3.枸杞；4.当归；5.板蓝根；6.保首乌；7.白芍；8.金银花；9.覆盆子；10.莲子图2 不同样本添加对硫磷的试纸条检测结果

4 结论

本研究以胶体金免疫层系技术为基础，用发光性极强的CdTe@SiO2荧光纳米颗粒标记物取代传统的胶体金标记物，制备有机磷荧光免疫层析试纸条，该技术为中药材的农药残留的检测，特别是有机磷类农药提供了一项新的快速检测方法。该方法对中药中有机磷(对硫磷、蝇毒磷、丰索磷)的检出限达到10～30 ng·g-1，优于传统胶体金法的200～500 ng·g-1[14-15]，具有较高的灵敏度，检测时间仅需15～20 min。该方法特异性较高，添加10倍量的三唑磷、克百威等农药对检测结果无影响，并且该方法适用性广，对多数农药样本均具有良好的检测效果。

随着生活水平的提高，人们对食品安全的关注也越来越多，特别是作为治病保健的中药，其质量安全更需要得到保障。农药在中药材的种植过程中被广泛使用，其残留可能严重危害人们的健康，因此对其进行监测具有重要意义[16-17]。本研究的有机磷荧光试纸条较传统的气相色谱法和液相色谱-质谱法等具有成本，操作，时间及便捷性上的巨大优势，可广泛应用于中药有机磷残留的现场筛查和检测，具有重要的经济价值和社会意义。

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