龟甲中具有潜在药理活性的miRNA初步筛选△

陈铭阳，胡小松，许贞，任广喜，芦海生，刘春生*

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.中国中医科学院 望京医院，北京 100102)

龟甲是一种常用中药，具有滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固经止崩的功效，常用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目眩、虚风内动、筋骨痿软、心虚健忘、崩漏经多等症[1]。现代研究发现，龟甲具有抗氧化活性[2-3]、提高机体免疫力[4]、促骨髓间充质干细胞增殖分化[5-9]等多种药理作用。已有报道的活性成分有无机元素[10-11]、甾体类[12-14]、氨基酸与多肽类[15-16]、多酚类[17]等。但是，目前龟甲的代表活性成分依然尚不清楚。

中医药的临床实践已经有几千年历史，但许多已被证明有确切疗效的中药依靠现有的分子医学理论依然无法给出合理的解释，提示了中药中存在着未知的药效机制。微小核糖核苷酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是指一类长度为20～22 nt、能够调控基因表达的非编码小分子RNA[18]，其广泛存在于动物、植物体内，并通过与靶基因互补或不完全互补的方式在转录后水平调节基因表达。研究表明，miRNA能作为一种信号分子在不同生命体间传播，跨物种对基因表达起到调控作用[19]。2011年，张辰宇课题组报道了一项重大发现，植物miRNAs可以通过饮食的方式进入人体血液和组织，它们可以通过调控人体内靶基因表达而影响人体生理功能[20]。2014年，该课题组进一步发现中药金银花中的miR2911能在动物体内传递并被吸收，并可通过靶向调控PB1、PB2基因抑制H1N1、H5N1、H7N9病毒的复制来治疗流感[21]。

尽管外源miRNA药效机制的相关研究在植物中已经取得一些成果，并有许多相关文献的支持[22-24]，但在药用动物中的研究还是空白，龟甲等常用动物药中是否也有稳定存在的miRNAs尚不清楚。笔者利用转录组测序、实时荧光定量PCR及计算机模拟技术对龟甲可能存在活性的功能miRNA进行初步筛选，为龟甲及其他动物药中新型活性成分的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

龟甲购自河北安国药材市场，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为《中华人民共和国药典》所载龟甲正品。乌龟及黄喉拟水龟购自广州水产品市场。样品信息如表1所示。

表1 龟甲及相关测试样品信息

1.2 总RNA提取

分别取适量龟甲、新鲜乌龟背甲、新鲜黄喉拟水龟背甲，使用无水乙醇洗净后捣碎，置于-80 ℃冷冻过夜后，再在真空低温冷冻条件下冻干备用。

总RNA的提取选用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)试剂盒，分别提取上述3个样品的总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度，Nanodrop检测RNA纯度以及Agilent2100检测RNA完整性。

1.3 miRNA文库构建和测序

采用Illumina TruSeq Small RNA试剂盒构建龟甲miRNA文库。以total RNA为起始样品，1 μg为起始量，分别在miRNA的3′端和5′端加上接头，然后使用随机引物反转录成cDNA。随后经过PCR扩增(11～12个循环)，对cDNA文库进行富集，再采用6% Novex TBE PAGE进行文库纯化。使用TBS380(Picogreen)对文库定量，cBot上进行桥式PCR扩增后利用Hiseq测序平台，进行SE50测序(由上海美吉生物公司完成)。其流程如图1所示。

图1 龟甲miRNA 文库构建流程

1.4 测序信息分析

测序信息分析采用Fastx-Toolkit(http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)与上海美吉生物自主开发软件，流程图如图2所示。

图2 龟甲测序信息分析流程图

1.4.1 数据质控和长度分析统计 原始数据下机之后，先统计原始数据的数据量、碱基质量等信息。随后对原始数据进行去接头、去除含未知碱基序列、去低质量碱基序列、长度筛选处理，获得clean small RNA 序列，并对高质量的测序结果(clean reads)进行长度分布统计。原始的FASTQ 数据里面含有带接头、低质量的序列(reads)，为了保证后续生物信息分析的准确性，需要对raw reads 进行质量控制，得到clean reads，之后的生物信息分析会基于clean reads 进行。具体质控步骤：1)去除reads 中的3′接头序列，去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；2)剪切3′端测序质量较低的碱基(质量值小于20)；3)去除含未知碱基N 的reads；4)去除长度过短的reads(<18nt)；5)去除长度过长的reads(>32 nt)。

1.4.2 序列去冗余、miRNA鉴定和表达量统计 首先，对clean reads 进行相同序列合并(去冗余)处理，这样可以方便后续分析。随后，将去冗余之后的clean reads与Rfam、miRBase的基因组序列比对，鉴定出已知和新的miRNA分子，分别获得各自的表达量即count值。由于乌龟在miRBase中没有对应物种的miRNA序列信息，研究中选择近缘物种海龟的基因组作为参考，若有注释信息，就用参考基因组中的miRNA序列注释测得的miRNA，将其余不能比对上的sRNA比对到参考基因组上，截取其周围序列，使用软件进行二级结构预测，根据预测结果利用Dicer酶切位点信息、能量值等特征进行过滤，鉴定出新的miRNA。对所有已知和新预测miRNA进行表达量统计，并利用Transcripts Per Million(TPM)进行表达量的均一化处理。

1.4.3 靶基因预测和功能分析 对分析得到的已知和新预测的miRNA利用miRanda软件(www.microrna.org)进行靶基因预测。由于本研究中主要探究的是龟甲中具有药效活性的miRNA，因此补充使用TargetScan预测工具(www.targetscan.org)对表达量较高的miRNA进行人转录组中靶基因预测。

1.5 实时荧光定量PCR

1.5.1 引物设计 实验选用转录组测序中count值超过10 000的miRNA进行绝对定量验证。选定测试基因后设计引物，如表2所示。

1.5.2 标准曲线的制备 将目的基因合成后克隆到质粒中，测定质粒浓度并计算其拷贝数，对照品以0.18 ng·μL-1的初始质量浓度进行10倍梯度稀释，每个质量浓度设置3个重复进行实时荧光定量PCR反应，并绘制扩增曲线。以对照品拷贝数的对数值为横坐标(X)，以测得的目的基因的Ct值为纵坐标(Y)构建标准曲线并计算得出线性方程。NW-006622633-1-195的标准曲线为Y=-3.012X+34.137，r=0.993；NW-006642957-1-500的标准曲线为Y=-3.38X+35.568，r=0.998；xtr-mir-22的标准曲线为Y=-3.415X+34.446，r=0.993，线性关系均良好。

1.5.3 绝对定量拷贝数计算 3个miRNA在各样品中进行实时荧光定量PCR实验后，根据其Ct值重合在标准曲线上的位置计算出目的基因在样品中的绝对拷贝数。

2 结果与分析

2.1 龟甲miRNA转录组测序结果分析

2.1.1 原始数据 原始数据统计结果显示，共产出11 021 113条原始序列，总碱基数为562 076 763 bp，碱基错误率为0.010 6%，Phred数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比分别为99.42%和98.15%，GC含量为55.33%。

表2 龟甲测序实时荧光定量PCR实验引物

样品原始数据中碱基质量值越高，说明测序错误率越低。样品原始数据碱基质量分布如图3所示，所获得的测序数据达到后续分析要求。

注：横坐标是表示reads 上从5′到3′端依次碱基的排列。图3 碱基质量分布图

2.1.2 原始数据质控后长度分布统计 从全部11 021 113条原始序列中去除接头序列201 318条、含未知碱基N的序列3612条、长度过短(<18 nt)的序列4 756 611条、长度过长(>32 nt)的序列1 017 128条后，共得到高质量的测序结果(clean reads)5 042 444条。质控之后，对clean small RNA 的reads 长度分布进行统计，龟甲样品在18～32 nt中大体呈正态分布，并在22 nt处出现高峰，统计结果见图4。

图4 clean reads 序列长度分布

2.1.3 已知miRNA鉴定及其表达分析 对龟甲样品中测得的miRNA进行鉴定，共得到578条已知miRNA，部分统计结果如表3、4所示。其中xtr-miR-22的count值超过10 000，其二级结构如图5所示。

2.1.4 新miRNA预测及其表达分析 对龟甲样品中测得的miRNA进行鉴定，共预测得到120条新miRNA，部分统计结果见表5、6。共两条miRNA的count值超过10 000，分别命名为NW-006642957-1-500和NW-006622633-1-195，其结构预测如图6所示。

表3 部分已知miRNA的count值统计结果

表4 部分已知miRNA的TPM值统计结果

图5 xtr-miR-22的二级结构

miRNA名称CountsNW⁃006642957⁃1⁃50019129NW⁃006622633⁃1⁃19510441NW⁃006615969⁃1⁃774606NW⁃006656176⁃1⁃6044543NW⁃006633404⁃1⁃3494538NW⁃006631183⁃1⁃3173736NW⁃006637514⁃1⁃4523088NW⁃006657619⁃1⁃6153071

表6 新预测miRNA的部分TPM值统计结果

图6 NW-006622633-1-195和NW-006642957-1-500的二级结构

2.1.5 靶基因预测 Count值最高的已知miRNA(xtr-miR-22)的靶基因预测结果如表7所示，在人转录组中靶基因预测结果如表8所示，得分最高的是PML基因，为早幼粒细胞白血病相关基因。

表7 xtr-mir-22靶基因预测结果

表8 xtr-mir-22靶基因预测结果

2.2 实时荧光定量PCR实验结果分析

实验选用count值超过10 000的1条已知miRNA(xtr-miR-22)和2条新预测miRNA(NW-006622633-1-195，NW-006642957-1-500)进行绝对定量验证，对各样品中3条miRNA的拷贝数进行计算，每个样品进行3个重复，结果如图7所示。

注：nw-1-195及nw-1-500分别代表2条新预测miRNA(NW-006622633-1-195，NW-006642957-1-500)；**表示该miRNA在各样品中的拷贝数有统计学差异(P<0.01)。图7 3个miRNA在各样品中的拷贝数计算结果

将实验获得的数据采用SAS8.2软件进行处理及单因素方差分析，结果显示NW-006622633-1-195在龟甲、乌龟动物背甲及乌龟同属动物黄喉拟水龟的背甲中拷贝数无明显统计学差异(P>0.05)，而NW-006642957-1-500及xtr-mir-22在各样品中拷贝数差异均有统计学意义(P<0.01)，其中xtr-miR-22在乌龟背甲中的拷贝数显著高于黄喉拟水龟背甲，在龟甲中的拷贝数显著高于乌龟背甲。

3 结论与讨论

本研究中采用miRNA转录组高通量测序对龟甲中可能存在的miRNA的结构进行预测，共得到三条count值超过10 000的miRNA序列：xtr-miR-22，NW-006642957-1-500以及NW-006622633-1-195。实时荧光定量PCR实验结果显示xtr-miR-22在乌龟背甲中的拷贝数明显高于同属的常用混伪品基原动物黄喉拟水龟的背甲，且其在龟甲中未发生明显的降解，可能为龟甲中具有药理活性的miRNA。靶基因预测结果显示xtr-miR-22可作用于PML基因以抑制其表达，而PML基因的表达能够抑制早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡并促进其增殖[25]，因此xtr-miR-22具有潜在的治疗早幼粒细胞白血病的药理活性。

尽管目前已有很多有关龟甲药效及其物质基础的报道，但由于龟甲本身成分极为复杂，这些研究多数停留于提取物及动物或细胞的表观变化上，而鲜有触及作用机制和药效物质基础的报道。有研究表明，益血生胶囊和补髓生血解毒汤等含龟甲的制剂能够治疗急性白血病化疗后的全血细胞减少症并降低不良反应[26-27]，龟甲在其中主要起到改善骨髓造血机制、提高机体免疫力的作用。虽然与本研究在龟甲中发现的xtr-miR-22的靶基因预测结果并不一致，但考虑到计算机靶基因预测具有局限性，且miRNA在时空表达中往往能够靶向调控多个基因，因此并不能排除miRNAs作为龟甲中具有生物活性的药效物质，笔者后续将设计靶向验证实验加以验证。

张辰宇课题组[21]在金银花miR2911的研究中证实植物类中药中存在结构极其稳定的miRNA，不仅在高温煎煮中没有发生大量降解，而且能够通过胃肠道后由肠上皮细胞传递至其他组织和器官，并通过靶向调控基因发挥其生物活性。对于人与小鼠等哺乳动物，植物miRNA属于外源miRNA，其结构与动物miRNA有一定区别，尚且能够跨界调控动物的基因，提示动物药中的miRNA亦具有通过胃肠道传递进入人体内并调控人基因的潜力。

本研究以龟甲为例，首次测序并验证了中药动物药中存在miRNAs，可能为中药中一类新型的具有药理作用的活性物质，为中药动物药活性物质研究及中药新药开发提供了新的思路及理论依据。

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