乳头状甲状腺癌患者外周血TSHR mRNA表达水平及其与临床特征的关系分析

左秀玲，王志宏，陈海燕

郑州市第一人民医院内分泌科，郑州 450004

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，其中乳头状甲状腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）是其最主要的病理类型，占甲状腺癌的80%[1]。PTC早期患者（Ⅰ～Ⅱ期）的5年生存率可达100%，Ⅲ期患者约为93%，而Ⅳ期患者仅为51%[2-4]；因此，PTC患者的早期诊断对增加其生存率十分重要。甲状腺癌相关肿瘤分子标志物是早期诊断的重要指标。有研究证实，多种肿瘤标志物与甲状腺癌的发生发展密切相关[5-6]，其中促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）是甲状腺组织的特异性标志物，在甲状腺功能和甲状腺细胞生长过程中具有重要的调节作用；然而，已有的研究多集中于TSHR蛋白在甲状腺癌组织中的作用，而其在PTC外周血中基因表达变化的研究相对较少，且多采用术后组织病理标本进行肿瘤标志物检测，达不到早期鉴别诊断的目的。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，体外检测PTC患者的外周血TSHR mRNA表达水平，探讨其在PTC鉴别诊断中的应用价值，并分析TSHR mRNA表达水平与临床特征的关系，为PTC的研究提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年1月至2016年6月郑州市第一人民医院确诊的50例PTC患者作为观察组，同期40例于郑州市第一人民医院体检的健康体检者作为对照组。观察组患者的纳入标准：①所有患者均于术后经病理学检查确诊；②临床资料完整；③初次手术；④术前未经放化疗和生物治疗。排除标准：①合并心、肝、肾功能不全；②伴其他恶性肿瘤。观察组50例患者中，男18例，女32例；年龄为26～75岁，平均为（43.4±8.2）岁；TNM分期：Ⅰ期有9例，Ⅱ期有12例，Ⅲ期有16例，Ⅳ期有13例；淋巴结转移：有淋巴结转移者16例，无淋巴结转移者34例。对照组40例受试者中，男16例，女24例；年龄为25～76岁，平均为（44.1±8.1）岁。两组受试者的年龄和性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。本研究经郑州市第一人民医院伦理委员会批准同意，所有受试者均签署本研究的知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样品收集与总RNA提取 采集观察组患者术前和对照组受试者清晨空腹外周静脉血5 ml，立即应用Trizol试剂（购于美国Sigma Aldrich公司）从受试者全血中提取总RNA。将提取的总RNA加入 20 μl水中溶解，测光密度（optical density，OD）值。当OD260/OD280≥1.8时，可用于后续研究。

1.2.2 实时荧光定量PCR技术 根据反转录试剂盒（购于日本Takara公司）的说明书，将RNA逆转录为cDNA。应用SYBR Green（购于日本Takara公司）染色，进行实时PCR分析。利用ABI7500系统（购于美国Applied Biosystems公司），按照制造商提供的方案在含1 μg cDNA的25 μl反应系统中进行实时荧光定量PCR反应，所有反应均重复3次。以β-actin作为内参，目的基因TSHRmRNA和内参β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平，引物序列如下：TSHR，Forward 5'-GCTTTTCAGGGACTATGCAATGAA-3'，Reverse 5'-AAGGGCAGTGACACTGGTTTGAGA-3'；β -actin，Forward 5'-CCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3'，Reverse 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3'。实时荧光定量PCR反应的条件：95℃下10 s，95℃下5 s，57.5℃下20 s，共40个循环。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析数据，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSHR mRNA的表达水平

观察组50例患者的外周血TSHR mRNA的平均表达水平为（1.82±0.28），明显高于对照组40例受试者的（1.01±0.03），差异有统计学意义（t=18.192，P﹤0.01）。

2.2 实时荧光定量PCR检测结果

TSHR和β-actin基因的熔解曲线均显示单峰，无引物二聚体形成，提示反应体系良好，无污染物干扰；扩增曲线显示引物质量良好，PCR产物未出现非特异性产物。（图1）

图1 实时荧光定量PCR检测结果

2.3 TSHR mRNA表达与临床特征的关系

PTC患者的外周血TSHR mRNA表达水平在性别、年龄、肿瘤直径方面比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）；PTCⅢ～Ⅳ期患者的TSHR mRNA表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义（F=14.381，P﹤0.01）；有淋巴结转移患者的TSHR mRNA表达水平明显高于无淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（t=4.453，P﹤0.01）。（表1）

3 讨论

实时荧光定量PCR技术具有准确性高和重复性好的优点，广泛应用于基因表达研究，仅需少量的外周血即可进行研究，可消除其他基因的干扰。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测PTC患者外周血样本中TSHR mRNA的表达水平，分析其与临床特征的关系，探讨TSHR mRNA在PTC诊断中的应用价值。当熔解曲线显示为单峰时，证明实时荧光定量PCR所用引物特异性高，无二聚体，且无其他非特异性扩增。本研究中TSHR mRNA的熔解曲线为单峰，且为避免基因组DNA对研究结果的干扰，本研究所有目的基因和内参基因引物扩增产物的长度均为90～150 bp，扩增效率相近，证明本研究的数据准确可靠。

表1 PTC患者外周血TSHR mRNA表达水平与临床特征的关系

促甲状腺激素与其受体TSHR是调控甲状腺功能的关键蛋白。正常情况下TSH与TSHR结合后可以激活腺苷酸环化酶和磷酸酯酶C，进而通过环磷酸腺苷、乙酰甘油和1，4，5-三磷酸肌醇传递信号，从而刺激甲状腺细胞生长，并参与调节甲状腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）、甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）和钠碘转动体（sodium iodide symporter，NIS）等表达，其中 TSHR在甲状腺的调控中起主导作用。已有研究证实，在正常的甲状腺细胞和癌细胞中均有TSHR表达，其表达水平存在差异[7]。王朝晖等[8]的研究显示，应用免疫组化法检测PTC组织和正常甲状腺组织标本中TSHR蛋白表达情况，PTC组织中TSHR蛋白表达高于正常甲状腺组织，这可能是甲状腺癌发生的早期标志。这些研究表明，TSHR可以作为诊断PTC的生物标志物。

过往研究多集中于甲状腺癌根治术后肿瘤组织中TSHR蛋白表达的变化，而外周血中其基因表达变化的研究较少。Ishikawa等[9]在甲状腺癌患者的外周血中发现了甲状腺细胞，且TSHR mRNA表达异常。Torosian等[10]的研究发现，正常人外周血中存在少量的甲状腺细胞。血液中TSHR mRNA的表达与循环中的癌细胞TSHR mRNA高表达有关[11]。这些研究表明，可以通过外周血甲状腺细胞中目的基因的变化情况诊断甲状腺疾病。本研究对外周血单核细胞中TSHR mRNA进行相对定量检测发现，PTC患者和健康受试者的外周血中均发现TSHR mRNA表达，且PTC患者的TSHR mRNA表达水平明显高于健康受试者，提示外周血细胞中TSHR mRNA表达水平升高与甲状腺病变有关。

刘翔和高明[12]采用免疫组化法检测侵袭性PTC患者肿瘤组织中TSHR蛋白表达情况，低分化、高侵袭性、有淋巴结转移的患者中TSHR蛋白表达水平明显降低，且其表达水平与肿瘤恶性程度呈明显负相关。许少伟等[13]的研究发现，PTC原发病灶中TSHR表达水平与患者的年龄、性别、TNM分期、淋巴结转移等均无关。本研究中发现，外周血TSHR mRNA的表达水平与PTC患者的年龄、性别、肿瘤直径无关，与之前研究一致；然而，本研究中有淋巴结转移者的外周血TSHR mRNA表达水平明显高于无淋巴结转移者（P﹤0.01），推测发生淋巴结转移的患者，其PTC癌细胞的侵袭性相对较强，更易于从组织中脱落而进入外周血，使外周血中甲状腺细胞数量增加，从而使TSHR mRNA表达水平升高。另外，本研究发现，Ⅰ～Ⅱ期PTC患者外周血TSHR mRNA表达水平明显低于Ⅲ～Ⅳ期患者（P﹤0.01），提示TSHR mRNA表达水平升高与PTC进展有关。

综上所述，外周血中TSHR mRNA表达水平升高与甲状腺病变有关，且与患者TNM分期和淋巴结转移情况有关。本研究中所选取的样本数量较少，且未同时研究其他TSHR相关生物标志物在PTC中的表达变化情况，在后续研究中需要进一步补充。

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