泮托拉唑对胃癌细胞MKN-45增殖与凋亡的影响

王凤记，卢艳君，程相钦

山东省寄生虫病防治研究所（山东省消化系统疾病防治中心）普外科，山东 济宁 272033

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别位居全国恶性肿瘤的第2位和第3位，且均呈逐年上升趋势[1-2]。质子泵抑制剂（ptoton pump inhibitors，PPI）作为一种抑酸药物，通过Vaculor H+-ATPase或H+/K+-ATPase，通过胃壁细胞，进入小管腔聚集发挥作用，常常用于酸性疾病的治疗，如胃溃疡、消化道出血、胃癌等[3-6]。泮托拉唑作为第三代PPI，不仅对酸具有稳定性，还有着良好的靶位专一性，比第二代PPI的生物利用度提高了7倍，而且不影响其他药物在肝脏中的代谢，因此被广泛地应用于多种酸性疾病的治疗当中，如能够降低胃溃疡发病率，对消化道出血疗效显著[7-8]。另外，相关研究还显示泮托拉唑能显著诱导SMCC-7721肝癌细胞凋亡，抑制HCT116结肠癌细胞及SGC-7901胃癌细胞增殖[9-11]。但泮托拉唑对于胃癌细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用机制报道较少，因此本研究将对此展开探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株

胃癌细胞MKN-45购于中国科学院细胞库。

1.2 试剂与仪器

泮托拉唑购自杭州中美华东制药有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E、GAPDH单克隆抗体均购自美国宜百康公司；四甲基偶氮唑盐（methye thiazolye telrazlium，MTT）、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；Hoechst染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自南通碧云天生物技术有限公司；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；DMI4000B倒置荧光显微镜购自德国莱卡公司；DYCZ-25D型双垂直电泳仪、DYCZ-25D型转印电泳仪均购自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；MK3酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法检测MKN-45细胞活力 将5×103个MKN-45细胞接种到6孔板，培养24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑处理MKN-45细胞48 h，加入20 μl的MTT孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μl的二甲基亚砜，振荡使结晶物溶解，在酶标仪波长560 nm处测光密度（optical density，OD）值。每组平行3个复孔。

1.3.2 Hoechst染色检测MKN-45细胞形态 将8×103个MKN-45细胞接种到6孔板，培养24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑处理MKN-45细胞48 h，PBS洗涤，加入4%多聚甲醛固定，Hoechst染色液染色5 min，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤，于荧光显微镜下观察并拍照，凋亡的细胞荧光更强，细胞核发白，呈现皱染。每组平行3个复孔。

1.3.3 流式细胞术检测细胞周期 将8×103个MKN-45细胞接种到6孔板，培养24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑处理MKN-45细胞48 h，收集1×105/ml个细胞，加入5µl的核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）并吹打均匀，37 ℃孵育1 h，再加入PI染液，室温避光孵育30 min，于1 h内采用流式细胞仪进行细胞周期检测分析。

1.3.4 Western blot检测细胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及Cyclin E蛋白的表达 将8×103个MKN-45细胞接种到6孔板，培养24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑处理MKN-45细胞48 h，收集细胞，加入细胞裂解液，裂解30 min，离心获得的上清液即是总蛋白。接着利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，后湿法转膜30～50 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗溶液（兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E、GAPDH单克隆抗体，稀释度为1∶100）孵育，4℃过夜；二抗溶液室温孵育1～2h。于凝胶成像系统中曝光。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）进行描述，多组间比较采用F检验，多组间两两比较采用q检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泮托拉唑对MKN-45细胞活力的影响

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45细胞48 h后，四组MKN-45细胞活力分别为（0.78±0.08）、（0.64±0.07）、（0.50±0.05）、（0.37±0.04），四组比较，差异有统计学意义（F=24.383，P=0.000）；且与 0 μg/ml比较，10、20、40 μg/ml泮托拉唑作用后MKN-45细胞活力明显降低，差异有统计学意义（P﹤0.01）。（图1）

图1 泮托拉唑对MKN-45细胞活力的影响

2.2 泮托拉唑对MKN-45细胞凋亡的影响

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用MKN-45细胞48 h后，经Hoechst染色实验发现，10、20、40 μg/ml泮托拉唑能使细胞核发白，呈现皱染。（图2）

图2 泮托拉唑对MKN-45细胞凋亡的影响（Hoechst染色，×200）

2.3 泮托拉唑对MKN-45细胞周期的影响

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用MKN-45细胞48 h后，经流式细胞术检测发现，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑能逐渐使细胞周期阻滞在G1期，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用后，G1期 MKN-45 细胞比例较0 μg/ml增高，差异有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

表1 泮托拉唑对MKN-45细胞周期的影响（%，±s）

表1 泮托拉唑对MKN-45细胞周期的影响（%，±s）

注：*与0 μg/ml泮托拉唑比较，P<0.01

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2.4 泮托拉唑对MKN-45细胞中Bax及Bcl-2表达的影响

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45细胞48 h后，与 0 μg/ml比较，20、40 μg/ml的泮托拉唑作用后MKN-45细胞的Bcl-2表达水平明显下调，Bax表达水平明显上调，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（图3、表2）

图3 Western blot检测泮托拉唑对MKN-45细胞中Bax及Bcl-2表达的影响

表2 泮托拉唑对MKN-45细胞中Bax及Bcl-2表达的影响（±s）

表2 泮托拉唑对MKN-45细胞中Bax及Bcl-2表达的影响（±s）

注：与0 μg/ml泮托拉唑比较，*P<0.01

泮托拉唑浓度（μg/ml）0（n=3）10（n=3）20（n=3）40（n=3）F值P值Bax/GAPDH 0.18±0.02 0.19±0.02 0.38±0.04*1.13±0.11*10.28 0.002 Bcl-2/GAPDH 0.94±0.09 0.93±0.09*0.42±0.04*0.28±0.03*25.55 0.000

2.5 泮托拉唑对MKN-45细胞中Cyclin D1及Cyclin E表达的影响

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45细胞48 h后，与0 μg/ml比较，10、20、40 μg/ml泮托拉唑能明显下调Cyclin D1及Cyclin E表达，差异有统计学意义（P﹤0.01）。（图4、表3）

图4 Western blot检测泮托拉唑对MKN-45细胞中Cyclin D1及Cyclin E表达的影响

表3 泮托拉唑对MKN-45细胞中Cyclin D 1及Cyclin E表达的影响（±s）

表3 泮托拉唑对MKN-45细胞中Cyclin D 1及Cyclin E表达的影响（±s）

注：与0 μg/ml泮托拉唑比较，*P<0.01

泮托拉唑浓度（μg/ml）0（n=3）10（n=3）20（n=3）40（n=3）F值P值Cyclin D1/GAPDH 0.92±0.09 0.29±0.02*0.16±0.01*0.05±0.00*38.45 0.000 Cyclin E/GAPDH 0.97±0.09 0.31±0.03*0.22±0.02*0.05±0.00*42.13 0.000

3 讨论

pH值对于细胞各种生理功能的发挥至关重要，参与H+跨膜运输的质子泵包括H+/K+，H+/Na+，V-ATPase等，而在真核细胞膜上起着重要作用的是V-ATPase。V-ATPase在肿瘤细胞中过度表达，抑制酵解所产生的乳酸在细胞内的聚集，继而使肿瘤细胞避免了凋亡的命运[3-6]。而作为V-ATPase抑制剂，PPI能够在pH﹤4的酸性环境中发挥抑酸作用，被广泛地应用于酸性疾病的治疗，且疗效及安全性均得到肯定[3-6]。已有研究证实，作为第三代PPI泮托拉唑已被广泛应用于酸性疾病的治疗当中，包括胃癌[7-8]。因此，本研究以泮托拉唑为研究对象，探讨泮托拉唑对胃癌细胞MKN-45增殖与凋亡的影响。

癌细胞的过度增殖、凋亡受限制是胃癌发生的重要原因[12-14]，因此，本研究首先参考相关文献并利用MTT法检测不同浓度的泮托拉唑对MKN-45胃癌细胞活力的影响，结果表明10、20、40 μg/ml泮托拉唑能明显降低MKN-45细胞活力（P﹤0.01），与以往学者研究报道一致[11]。接着利用Hoechst染色检测泮托拉唑对胃癌细胞凋亡的影响，结果表明泮托拉唑能显著诱导细胞凋亡。细胞周期G1、S、G2期是细胞周期的主要调控点，也是众多抗肿瘤药物作用的主要靶点，特别是G1期。G1期是决定细胞是否能够进入S期，是否能够正常进行DNA复制及是否能够进行有丝分裂的前提[15-16]。所以本研究继续利用流式双染技术检测泮托拉唑对MKN-45胃癌细胞周期的影响，结果表明泮托拉唑能使细胞周期阻滞于G1期，从而说明泮托拉唑能通过阻滞细胞周期抑制MKN-45细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

胃癌的发生机制与众多肿瘤类似，涉及细胞凋亡基因的异常和细胞周期的紊乱等[12-13]。细胞凋亡受细胞凋亡相关基因的调控，Bcl-2家族是研究最为广泛的细胞凋亡调控家族。其中抑凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax形成异二聚体，阻断凋亡信号的传递，促进细胞的存活与生长[17]。而Bax还能够自身形成二聚体，将凋亡信号传递到Caspase家族，使信号放大，最后诱导细胞凋亡[18]。Cyclin D1、Cyclin E是与G1期密切相关的细胞周期蛋白，Cyclin D1在生长因子等刺激下，与细胞周期依赖性蛋白4/6（CDK4/6）形成复合物，促进Rb磷酸化，并使转录因子E2F进入细胞核，调控细胞靶基因转录，推动DNA复制所需蛋白质的合成[19]。而在Cyclin D1被降解后，Cyclin E与CDK2形成复合物，代替Cyclin D1发挥作用，促使G1期向S期转变，推动细胞周期向DNA复制发展[20]。因此，本研究继续利用Western blot检测泮托拉唑对MKN-45细胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及Cyclin E表达的影响，结果表明泮托拉唑能明显下调Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表达，上调Bax的表达（P﹤0.01），从而阻滞细胞周期于G1期，并诱导细胞凋亡。

综上所述，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑能明显降低MKN-45胃癌细胞活力，诱导细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G1期，此过程可能是通过下调Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表达，上调Bax的表达实现的。

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