纤维支气管镜检标本微小RNA-21在非小细胞肺癌诊断中的临床应用价值

王艳春，于呈伟，齐颖会，刘振来

朝阳市第二医院1呼吸内科，2心胸外科，辽宁 朝阳 122000

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，近几年肺癌的发病率持续上升，病死率居高不下，严重威胁着人类健康[1-2]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%左右，且发病率和病死率持续上升[3]。肺癌在早期并无明显症状，大多数患者仅会出现一些常见的呼吸道症状，如咳嗽、胸闷等，大部分患者在就诊时已处于晚期，错过了最佳治疗时机，导致患者的5年生存率大大降低[4]。尽早发现、及时诊断、尽快治疗是降低肺癌病死率的根本方法。研究发现，微小RNA（miRNA）在肿瘤的发生和发展过程中起着至关重要的作用[5]。已有研究证实，微小RNA-21（miRNA-21）与甲状腺乳头状癌、肝癌等多种恶性肿瘤存在一定的相关性[6]。本研究通过检测miRNA-21在NSCLC患者中的表达水平，并探讨其与细胞因子和肿瘤标志物水平的相关性，旨在为NSCLC的预防和治疗提供理论依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月至2017年9月于朝阳市第二医院接受治疗的80例NSCLC患者作为NSCLC组。纳入标准：①年龄≥18岁；②通过影像学和病理学检查确诊为NSCLC；③无其他系统严重疾病。排除标准：①临床资料不全者；②合并其他部位原发肿瘤或肺部炎性疾病者。选取同期因咳痰、咯血等不适接受镜检筛查的80例肺炎或肺结核患者作为对照组。NSCLC组中，男52例，女28例；年龄52～78岁，平均（62.35±5.02）岁；鳞癌25例，腺癌25例，大细胞癌30例。对照组中，男50例，女30例；年龄50～79岁，平均（62.39±4.43）岁。两组患者的年龄、性别比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，且所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 纤维支气管镜检 患者术前禁食7 h，术前30 min静脉滴注阿托品0.02～0.03 mg/kg以减少呼吸道分泌物，静脉注射咪达唑仑0.3～0.4 mg/kg进行镇静，并给予供氧。患者取仰卧位，根据患者具体情况给予适当全身镇静。使用异丙酚静脉注射进行复合麻醉，将支气管镜从患者鼻腔插入，采用CT对肿瘤进行探查，并取出部分组织放入含RNAlater试剂的冻存管中，于-80℃环境下保存备用。

1.2.2 miRNA-21表达水平的检测 采用RNA提取试剂盒（购自美国Promega公司）提取总RNA，使用分光光度仪对RNA的浓度和纯度进行检测。采用TaqMan miRNA reverse transcription kit合成全长互补脱氧核糖核酸。利用PCR仪进行荧光定量PCR检测，以RNU6B作为内参反应体系，反应条件：15 ℃ 30 min，40 ℃ 30 min，85 ℃ 4 min，4℃储存。应用2-△△CT法计算miRNA-21表达水平。

1.3 评价指标

观察两组患者的镜检物miRNA-21表达水平，比较两组患者的细胞因子水平，包括γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）；比较两组患者的肿瘤标志物水平，包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神经元特异烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）和角蛋白 CYFRA21-1。分析miRNA-21水平与细胞因子、肿瘤标志物水平的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.5软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关分析法。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镜检物miRNA-21表达水平的比较

NSCLC组患者的镜检物miRNA-21表达水平为（8.29±1.15），明显高于对照组的（1.35±0.41），差异有统计学意义（t=50.842，P﹤0.001）。

2.2 细胞因子水平的比较

NSCLC 组患者的 IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6 和TNF-α水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.001）。（表1）

表1 两组患者细胞因子水平的比较（ng/L，±s）

表1 两组患者细胞因子水平的比较（ng/L，±s）

2.3 肿瘤标志物水平的比较

NSCLC组患者的CEA、NSE和CYFRA21-1水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.001）。（表2）

2.4 NSCLC患者镜检物miRNA-21表达水平与细胞因子和肿瘤标志物水平的相关性

NSCLC患者镜检物miRNA-21表达水平与细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和肿瘤标志物CEA、NSE、CYFRA21-1水平均呈正相关（P﹤0.05）。（表3）

3 讨论

近年来肺癌的发病率和病死率呈逐年上升趋势，目前已成为全球病死率最高的恶性肿瘤[7-8]。NSCLC是肺癌的一种，占肺癌的80%～85%，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比，其癌细胞生长分裂较为缓慢，扩散转移相对较晚[9]。目前认为，吸烟是引发肺癌最重要的高危因素，同时辐射、肺部感染、遗传等因素也是引发肺癌的原因[10]。肺癌患者在患病早期无特殊症状，常表现为胸部胀痛、痰血、低热和咳嗽等，晚期症状则表现为呼吸困难、体重骤减、咳嗽严重、咯血等。尽管近年来手术、放疗、化疗等技术不断发展，但多数肺癌患者在就诊时已处于晚期，肿瘤多发生了转移，导致患者失去了最佳治疗时机，5年生存率大大降低[11]。

表2 两组患者肿瘤标志物水平的比较（μg/ml，±s）

表2 两组患者肿瘤标志物水平的比较（μg/ml，±s）

组别CEA NSE CYFRA21-1

表3 NSCLC患者镜检物miRNA-21表达水平与细胞因子和肿瘤标志物水平的相关性

目前临床上对miRNA已有较多的研究，人类已经发现了500多种miRNA[12-13]。miRNA是一类高度保守的内源性非编码单链RNA，长度为18～25个核苷酸，由高等真核生物基因组编码，通过对基因的表达进行调节从而参与一系列生命过程[14-15]。miRNA的主要功能之一是作为基因表达的负调控因子，对细胞的增殖、凋亡、分化和代谢起到了至关重要的作用，但其作用部位和确切的生物学功能尚未确定[16-17]。研究显示，miRNA-21位于染色体的脆性区17q23.2，其可能作为一种潜在的癌基因或抑癌基因对肿瘤的发生和发展过程产生影响[18]。miRNA-21可能与癌细胞的发生、发展和转移有关，如在甲状腺乳头状癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌中表达水平明显上升，发挥着癌基因的作用[19]。另有研究通过miRNA芯片与生物信息学技术人工合成miRNA-21序列，并转染至肺癌A549细胞中，检测细胞中PTEN基因的mRNA和蛋白表达水平，结果发现miRNA-21可能主要在翻译水平上调控PTEN基因的表达[20]。

本研究探讨了miRNA-21在NSCLC患者中的表达水平，结果显示，NSCLC组患者的镜检物miRNA-21表达水平为（8.29±1.15），明显高于对照组的（1.35±0.41），差异有统计学意义（t=50.842，P﹤0.001），表明miRNA-21在NSCLC组织中的表达水平较高，其可能通过调控凋亡相关基因的表达，从而参与肿瘤的发生和发展，进一步证实了miRNA-21的癌基因作用。炎性细胞因子在人体内通常保持平衡状态，但一旦引起炎症，平衡就会被破坏，导致肺部发生病理生理性改变。本研究对两组患者的细胞因子水平进行比较，结果发现，NSCLC组患者的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.001），表明肿瘤细胞可通过分泌炎性细胞因子介导炎性反应，从而促进肿瘤的发生、侵袭和免疫抑制。通过对两组患者的肿瘤标志物水平进行比较，结果发现，NSCLC组患者的CEA、NSE和CYFRA21-1表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.001）。本研究还发现，NSCLC患者镜检物miRNA-21表达水平与细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和肿瘤标志物CEA、NSE、CYFRA21-1水平均呈正相关（P﹤0.05），证实了miRNA-21可以作为肺癌的特异性肿瘤标志物，对肺癌的诊断和预后具有一定的应用价值。

综上所述，miRNA-21在NSCLC组织中的表达水平明显升高，且与细胞因子和肿瘤标志物水平密切相关，其对肺癌的发生和发展过程起到了重要作用，可应用于NSCLC患者的早期诊断及预后判断，值得进行深入研究。

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