可结合Caco-2细胞表面蛋白的副溶血弧菌外膜蛋白的筛选与鉴定

陈 萌，李卓昱，鲍玉杰，袁增智,2*

(1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)为嗜盐类革兰氏阴性菌，短杆状，无芽孢，带有鞭毛。VP主要分布在海洋环境中，是重要的食源性病原[1-2]，已经成为世界性公共卫生问题之一。VP除了会感染人的肠道，引起腹泻和肠胃炎，还能感染海洋动物，例如虾类，感染后会引发虾类的红腿病。目前对于弧菌的治疗手段普遍是采用抗生素，病菌的抗药性也在不断增强[3]，寻找新的药物靶标对于开发新型VP感染治疗药物非常关键。

已报道的VP毒力作用因子有侵袭因子、外膜蛋白、尿素酶、黏附因子、蛋白酶、脂多糖、溶血毒素等[4]。而病原体表面蛋白与宿主受体之间的识别和黏附过程是病原体侵染的首要因素，因此对VP黏附机制的研究尤为重要。Jiang等[5]通过黏附和抑制试验发现VP表面的烯醇酶对上皮细胞有黏附作用。Gingras等[6]通过对比神奈川阳性菌和阴性菌发现，VP普遍对于人肠道的上皮细胞具有黏附作用。Nakasone等[7]通过VP纯化的菌毛或纯化的菌毛抗体处理兔的肠道细胞，发现VP不能继续黏附肠道，推测VP的菌毛对肠道的黏附过程起到重要作用。Caco-2细胞株来源于人结肠癌细胞，在结构和功能上与人小肠上皮细胞相似，因此笔者以Caco-2细胞作为研究对象，探究其与副溶血弧菌外膜蛋白间的黏附作用。

VP的外膜蛋白位于菌体表面，特殊的位置决定了外膜蛋白在侵染宿主的过程中可能起到黏附的作用。笔者采用基于生物素化的亲和层析技术对VP黏附Caco-2细胞相关的外膜蛋白进行筛选和初步鉴定。

1 材料与方法

1.1材料副溶血弧菌NY-172株是由天津水生动物疫病预防控制中心提供；Caco-2细胞，大肠杆菌DH5α菌株、BL21(DE3)菌株，pET-28a质粒为天津师范大学生命科学学院水生生物学实验室保存。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器。PCR仪(BIO-RAD，北京伯乐技术开发公司)、凝胶成像仪(GDS-8000，北京六一仪器厂)、电泳仪(DYY-6C)、核酸蛋白检测仪(BIO-RAD)、电泳槽(DYCZ-28A，北京六一仪器厂)。

1.2.2试剂。SalⅠ和XhoⅠ限制性酶(TaKaRa公司)；LB固体、液体培养基(生工生物工程股份有限公司)；NHS-PEG4-Biotin、DMEM、胰酶、血清、青霉素链霉素双抗、Chemiluminescent Substrate显色液(Thermo Fisher Scientific)；His标签单抗、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、辣根过氧化物酶(horeradish peroxidase,HRP)羊抗鼠标记的二抗(天津三箭生物技术有限公司)；同源重组连接酶(Vazyme公司)。

1.3方法

1.3.1Caco-2细胞表面蛋白的生物素化标记。待Caco-2细胞培养至单层，倒去DMEM培养基，PBS冲洗3次后将细胞刮下置于15 mL无酶管中离心后收集。沉淀用PBS冲洗3次，重悬至2.5×107个/mL，添加终浓度为2 mmol/L的NHS-PEG4-Biotin试剂，于4 ℃下孵育30 min，用PBS冲洗3次；添加100 mmol/L的甘氨酸置于4 ℃下反应15 min，使用PBS冲洗3次；按照1∶250的比例加入FITC置于37 ℃下反应30 min，用PBS冲洗3次；使用荧光显微镜观察，并扫描记录。将剩余细胞加入裂解液进行裂解，4 ℃下反应30 min，4 ℃、1 200 r/min离心取上清，保存于-80 ℃备用。

1.3.2副溶血弧菌外膜蛋白的提取。参考王忠等[8]和周丽等[9]的方法提取VP的外膜蛋白。取150 mL过夜培养的菌液，4 ℃、6 000 r/min离心20 min。用含有EDTA的Tris-HCl溶液重悬菌体，洗涤沉淀3次，弃上清；加入10 mL含有20 mmol/L PMSF的PBS重悬菌体，并置于45 ℃水浴中40 min，超声波破碎5 min(振幅39%，破碎5 s，间隔5 s)，超速离心机140 000 r/min离心30 min，取上清收集外膜蛋白。

1.3.3与Caco-2细胞表面蛋白结合的VP外膜蛋白的筛选。将自旋柱做好标记，设置对照组，用PBS冲洗柱子3次；加入200 μL中性卵白素树脂，4 ℃ 500 r/min离心1 min；用PBS平衡柱子2次，4 ℃ 500 r/min离心1 min；将生物素化标记的Caco-2细胞作为试验组，以PBS缓冲液作为对照组，均加入到自旋柱中，上下颠倒混匀15 min，4 ℃ 500 r/min离心1 min；2组自旋柱分别加入封闭液，于室温封闭15 min，4 ℃ 500 r/min离心1 min；加入副溶血弧菌的外膜蛋白与之互作，上下颠倒60 min，4 ℃ 500 r/min离心1 min，用洗涤缓冲液清洗5次；添加刚好没过树脂的洗脱溶液，先室温反应3～5 min，后4 ℃下500 r/min离心1 min，收集流穿液，送上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱鉴定。

1.3.4基因克隆、原核表达及蛋白纯化。通过质谱鉴定得到3个副溶血弧菌候选外膜蛋白，在NCBI上分别搜索到ATP synthase subunit alpha、ATP synthase subunit beta、outer membrane protein U蛋白的基因编码序列，通过SignalP和THMHH在线软件预测后，除去信号肽或跨膜区，使用primer primer 5.0设计同源重组上下游引物(表1)。同时试验过程中使用已报道过的黏附因子VpadF作为阳性对照。

提取VP基因组DNA作为模板，PCR扩增出序列全长，对其进行纯化胶回收，与pET-28a质粒经SalⅠ和XhoⅠ双酶切的线性化产物进行同源重组连接，得到pET-28a-ATPα、pET-28a-ATPβ、pET-28a-OmpU重组质粒，送样测序。

将测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌中，参照杜欣军等[10]的方法进行相应蛋白的表达和纯化，简述如下：先实施小量诱导表达，待确定最佳的诱导条件后进行大规模诱导表达，利用Ni柱进行亲和层析纯化，对于表达在包涵体中的蛋白用尿素进行梯度复性，使其恢复活性并透析于PBS缓冲液中保存。

表1 PCR引物序列

1.3.5Western blot检测重组蛋白。用5 μg的重组蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，浓缩胶80 V，分离胶120 V电泳分析，PVDF膜先用甲醇浸泡5～10 min，再用转膜缓冲液浸泡20～30 min进行转膜，置于冰上300 mA、2 h；用去离子水洗涤PVDF膜除去SDS，放到封闭液中封闭过夜，用TBST洗3次，使用His标签单克隆抗体常温孵育2 h，TBST洗3次；用HRP标记的羊抗鼠二抗常温孵育2 h，TBST洗3次，使用Thermo Chemiluminescent Substrate显色液，使PVDF膜浸泡其中显色，BIO-RAD凝胶成像仪扫描并保存。

1.3.6间接免疫荧光验证黏附作用。待Caco-2细胞培养至12孔板中长成单层时，每个孔中加入相应200 μg重组蛋白，37 ℃ 孵育30 min；PBS冲洗3次，用PBS将多聚甲醛稀释到浓度为4%(V/V)的反应液，添加到12孔板中，常温反应15 min，PBS冲洗3次；使用His单克隆抗体，常温反应30 min，PBS冲洗3次；使用HRP标记的羊抗鼠二抗，常温反应30 min，PBS冲洗3次；荧光显微镜观察，扫描并保存。

2 结果与分析

2.1Caco-2细胞表面蛋白的生物素化标记为了提取Caco-2细胞表面的蛋白作为垂钓诱饵，使用NHS-PEG4-Biotin 试剂对Caco-2细胞表面的蛋白进行生物素化。由于该试剂高度亲水，因此正常情况下无法穿透细胞膜，只有细胞表面的蛋白才会被生物素化。进一步利用Avidin与生物素的特异性结合作用来证明生物素化是否成功。将FITC-Avidin分别与生物素化的Caco-2细胞和未生物素化的Caco-2细胞孵育，显微镜观察结果如图1所示。结果能看到生物素化的细胞表面有明显的荧光，而对照组无荧光，证明Caco-2细胞表面蛋白成功生物素化，可用于下一步的筛选。

2.2副溶血弧菌外膜蛋白提取将PMSF法提取的外膜蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测分析，结果如图2所示。可以看到外膜蛋白的大小集中在20～90 kD，条带清晰且均匀，说明PMSF方法适用于副溶血弧菌外膜蛋白的提取，外膜蛋白可用于下一步试验。

2.3与Caco-2细胞表面蛋白结合的副溶血弧菌外膜蛋白的筛选利用卵白素树脂与生物素的亲和作用，将Caco-2细胞进行生物素化并固定于卵白素树脂，与提取到的VP外膜蛋白进行孵育，亲和垂钓副溶血弧菌的外膜蛋白。用洗脱缓冲液洗脱树脂，分别取洗脱物进行LC-MS/MS质谱鉴定，结果见表2。通过与对照组比较，筛选出ATPα、ATPβ、OmpU共3个蛋白。经在线软件SignalP 4.1 server预测分析ATPα、ATPβ均无信号肽,OmpU序列1～21区域的氨基酸存在信号肽。在线软件TMHMM server v 2.0预测分析结果显示ATPα、ATPβ、OmpU均无跨膜区，为胞外蛋白。

注：a.生物素化后的Caco-2细胞;b.未生物素化的Caco-2细胞Note: a.Caco-2 cell of pre-biotinylation;b.Caco-2 cell of post-biotinylation图1 FITC-Avidin标记生物素化的Caco-2细胞Fig.1 Detection of biotinylated Caco-2 cells by FITC-Avidin

注：M.Marker;1.PMSF法提取的外膜蛋白Note:M.Marker;1.the outer membrane proteins with PMSF methods图2 SDS-PAGE分析PMSF法提取外膜蛋白Fig.2 SDS-PAGE profiles of the outer membrane proteins with PMSF methods

表2候选外膜蛋白质谱鉴定及其生物信息学分析

Table2Massspectrumidentificationandbioinformaticsanalysisofcandidateoutermembraneproteins

蛋白名称Nameofprotein质谱鉴定肽段数Numberofpeptidefragmentidentifiedbymassspectrum相对分子质量Relativemolecularmass预测是否胞外蛋白PredictionofextracellucarproteinATPα2956．0×103是ATPβ2650．0×103是OmpU3336．0×103是

2.4重组蛋白进行基因克隆、原核表达、蛋白纯化及Westernblot检测将送测正确的重组质粒转化至大肠杆菌中，对其实施大规模诱导表达，利用亲和层析技术纯化蛋白，结果如图3a所示。蛋白分子量符合预期，条带清晰且单一。进一步运用Western blot试验检测重组蛋白与多聚组氨酸标签抗体的识别作用，结果如图3b所示。结果显示3种重组蛋白均可以被带有多聚组氨酸标签抗体识别，可以被用来进行下一步试验。

注：M.Marker;1.ATPα;2.ATPβ;3.OmpU图3 各重组蛋白纯化结果(a)及检测(b)Fig.3 Purification of recombinant protein and Western blot detection

2.5间接免疫荧光验证黏附作用该研究运用间接免疫荧光法来验证纯化的重组蛋白ATPα、ATPβ、OmpU与Caco-2细胞之间是否存在黏附作用，结果如图4所示。通过荧光显微镜观察看到重组蛋白与阳性对照组VpadF对比都有较强的荧光，而空白组(PBS)和阴性对照组(BSA)没有任何荧光，表明重组蛋白ATPα、ATPβ、OmpU与Caco-2细胞存在黏附作用。

注：a.PBS;b.BSA;c.VpadF;d.ATPα;e.ATPβ;f.OmpU图4 间接免疫荧光验证各重组蛋白与Caco-2细胞间的相互作用Fig.4 Confirmation of the interaction between recombinant proteins and Caco-2 cells by indirect immune-fluorescence assays

3 讨论

病原体表面蛋白与宿主靶细胞受体的黏附作用是病原体侵染的重要环节。该研究首次将Caco-2细胞表面蛋白进行生物素化，利用生物素与卵白素树脂的天然亲和性，制成有特异性的固相载体，使用层析方法筛选出来能与Caco-2细胞表面相互作用的VP外膜蛋白，垂钓得到3个候选蛋白。ATP合成酶是生物能量代谢的重要酶，不同来源的ATP合成酶都具有相同的组成单位和亚基，是结合部分F1和处于膜内部亲脂的F0，F1包括α、β、γ、ε、σ这5个亚基[11]。邢林林等[12]通过表达培养沉默ATP合成酶的菌株发现其几乎不生长于TSB培养基中，在培养过程中加入外源的ATP同样不能生长，推测外源的ATP不能代替细菌的原有ATP合成路径，从而证明ATP合成酶与细菌的生长密切相关。而细菌中ATP合成酶是否参与了黏附宿主的过程目前尚无明确报道。弧菌外膜蛋白中的OmpU是重要的抗原，其序列在弧菌中有较高的同源性。试验证实OmpU对哈维氏弧菌[13]、副溶血弧菌[14]、鳗弧菌[15]和 溶藻弧菌[16]均表现出很好的免疫保护作用。除此之外，Aeckersberg等[17]还发现费氏弧菌中OmpU能帮助其定殖在宿主的新生发光器官中，从而推测OmpU可能是具有黏附作用的外膜蛋白。该研究通过原核表达和蛋白纯化技术成功得到3个重组蛋白，并进行间接免疫荧光试验验证其功能。将VP黏附因子VpadF作为阳性对照，发现ATPα、ATPβ、OmpU均能与Caco-2细胞黏附，其中ATPβ的黏附作用最强。因此推测3个候选蛋白均是潜在的黏附因子。

综上所述，该研究筛选出VP外膜蛋白中的3个潜在黏附因子ATPα、ATPβ、OmpU。该研究成果将有助于探究VP侵染宿主的致病过程，为下一步病原菌预防和防治新型药物开发奠定基础。

[1] KONDO H,TINWONGGER S,PROESPRAIWONG P,et al.Draft genome sequences of six strains ofVibrioparahaemolyticusisolated from early mortality syndrome/acute hepatopancreatic necrosis disease shrimp in Thailand[J].Genome announcements,2014,2(2):221-234.

[2] WANG J J,SUN W S,JIN M T,et al.Fate ofVibrioparahaemolyticuson shrimp after acidic electrolyzed water treatment[J].International journal of food microbiology,2014,179:50-56.

[3] 刘祥.溶藻弧菌外膜蛋白OmpU的原核表达、抗原性鉴定与生物信息学分析[J].华北农学报,2015,30(6): 37-43.

[4] 张德福,付绪磊,张明,等.副溶血弧菌毒力因子及致病机理的研究进展[J].食品科学,2015,36(7):216-222.

[5] JIANG W,HAN X G,WANG Q,et al.Vibrioparahaemolyticusenolase is an adhesion-related factor that binds plasminogen and functions as a protective antigen[J].Applied microbiology & biotechnology,2014,98(11): 4937-4948.

[6] GINGRAS S P,HOWARD L V.Adherence ofVibrioparahaemolyticusto human epithelial cell lines[J].Applied and environment microbiology,1980,39(2): 369-371.

[7] NAKASONE N,IWANAGA M.Pili of aVibrioparahaemolyticusstrain as a possible colonization factor[J].Infection & immunity,1990,58(1): 61-69.

[8] 王忠,邓灯,程顺峰,等.鱼肠道弧菌外膜蛋白抗原性分析[J].水产科学,2010,29(8):455-459.

[9] 周丽,刘洪明.鳗弧菌、溶藻胶弧菌外膜蛋白的分离及特性[J].中国水产科学,2003,10(1):31-35.

[10] 杜欣军,张伟伟,孙伟英,等.凡纳滨对虾原肌球蛋白基因表达模式与重组表达[J].渔业科学进展,2009,30(4):38-43.

[11] 刘平.基于ATP合成酶的新型抗结核化合物的设计、合成和生物活性评价[D].长春：吉林大学,2010.

[12] 邢林林,卢凤英,愈慧,等.鸭疫里默氏杆菌ATP合成酶F1亚单位α亚基的部分生物学特性研究[J].中国预防兽医学报,2015,37(4): 266-269.

[13] WANG Q,CHEN J,LIU R,et al.Identification and evaluation of an outer membrane protein OmpU from a pathogenicVibrioharveyiisolate as vaccine candidate in turbot (Scophthalmusmaximus)[J].Letters in applied microbiology,2011,53(1): 22-29.

[14] 刘瑞,赵明君,杨慧,等.副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)tdh2基因和鳗弧菌(V.anguillarum)ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆(Scophthalmusmaximus)免疫保护作用[J].海洋与湖沼,2011,42(4): 580-586.

[15] SUN Y,ZHANG M,LIU C S,et al.A divalent DNA vaccine based on Sia10 and OmpU induces cross protection againstStreptococcusiniaeandVibrioanguillarumin Japanese flounder[J].Fish & shellfish immunology,2012,32(6): 1216-1222.

[16] CAI S H,LU Y S,WU Z H,et al.Cloning,expression ofVibrioalginolyticusouter membrane protein-OmpU gene and its potential application as vaccine in crimson snapper,LutjanuserythropterusBloch[J].Journal of fish diseases,2013,36(8): 695-702.

[17] AECKERSBERG F,LUPP C,FELICIANO B,et al.Vibriofischeriouter membrane protein OmpU plays a role in normal symbiotic colonization[J].Journal of bacteriology,2001,183(22):6590-6597.