头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌的药动/药效学研究

张尤贞，颜秀梅，汤春莲，李 珲，蔡一杰，许晓靖，吴 勋

(1.安徽省兽药饲料监察所，安徽合肥 230091；2.安徽华澳生物技术有限公司，安徽合肥 230001)

目前，抗生素耐药性的产生已严重威胁人类和动物的健康。一些观点认为，抗生素的不规范使用(包括不合理的剂量、给药途径、给药间隔等)，是导致细菌耐药性产生的主要原因。因此，为了设计更合理的给药方案，笔者将药动学与药效学数据进行整合，以期在提高疗效的同时，减少耐药菌株的产生。

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)是猪细菌性肺炎的一种重要病原菌，能够引起猪的胸膜肺炎，是猪的一种严重的呼吸系统传染病。病猪呈现发热(可高达42 ℃)，呼吸困难，剖检时可发现纤维素性胸膜肺炎，多感染肺部两侧，65%的肺尾叶感染严重，发病率达到2%～10%，致死率约10%[1]。耐过猪可以携带病原持续几个月)[2]，感染后仍保持健康的动物就成为亚临床病原携带者。一旦暴发该病,推荐尽快采用抗生素治疗方法，早期及时治疗是提高疗效的重要条件。头孢类、四环素类等抗生素都可用于临床治疗[3]。

头孢喹肟是第4代头孢菌素类抗生素，也是兽医专用药，目前已被用于治疗由嗜血杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌等引起的呼吸道疾病以及由大肠杆菌和链球菌引起的乳房炎等疾病。目前，头孢喹肟已在兔[4]、猪[5]等动物体内进行药动学试验。然而，关于头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌的半体内药动药效学研究鲜见报道。

PK/PD同步模型可以反映药物浓度与杀菌效应之间的关系，能反映给药后出现的时间-浓度-效应过程，真实模拟宿主、药物以及细菌三者的动态相互变化关系。PK/PD模型[6]可大致分为体外PK/PD模型、半体内PK/PD模型、体内PK/PD模型3种。笔者利用半体内PK/PD同步模型，研究头孢喹肟在动物体内的动力学过程和药动学参数，旨在为治疗由胸膜肺炎放线杆菌引起的呼吸道疾病提供合理的治疗方案并减少临床上耐药菌的出现。

1 材料与方法

1.1药品与试剂硫酸头孢喹肟注射液(2.5% Cobacton)，批号A621B01，购自英特威国际有限公司；头孢喹肟对照品，含量80.9%，批号k0321205，购自中国兽医药品监察所；乙腈，HPLC级，含量≥99.9%，购自美国Fisher公司；甲酸，HPLC级，含量≥99.9%，购自美国Fisher公司；胰蛋白胨大豆肉汤培养基Tryptic Soy Broth (TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基Tryptic Soy Agar (TSA)、新生牛血清和NAD氧化辅酶I均购自于国产生化试剂公司。

1.2试验动物及试验菌株

1.2.1试验动物及其饲养管理。健康杂种猪(长白×大白×杜洛克)10头，体质量25～30 kg，购自安徽省某种猪场。整个试验期间，全部猪只自由饮水和采食，饲料为不含任何抗菌药物的全价日粮。

1.2.2试验菌株。胸膜肺炎放线杆菌来自临床分离菌株(生物I型中的1型)，保存于大豆卵磷脂肉汤(含5%NAD)中。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213，购自中国兽医药品监察所。

1.3菌液的复苏和制备将冷冻保存的多杀性巴氏杆菌接种到含5%新生牛血清的TSB肉汤培养基中，37 ℃摇床过夜培养，复苏后的细菌划线接种在含5%NAD的琼脂培养基上，传代培养5代，待细菌活力完全恢复后，再取单个菌落接种于含5%NAD的TSB肉汤培养基中扩菌培养，以获取对数生长期的细菌。

1.4胸膜肺炎放线杆菌在肉汤培养基和血清中的最小抑菌浓度(MIC)的测定采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，具体试验步骤参考CLSI。先将头孢喹肟储备液(1 280 μg/mL)用含5%NAD的TSB肉汤培养基和血清在10 mL无菌玻璃管中倍比稀释成试验所需的工作液。然后，再将稀释好的工作液与处于对数期的菌悬液按照1∶1的体积比加入96孔板中，使96孔板中的菌液终浓度为5×105CFU/mL左右。同时，在96孔板上设置阳性对照孔(只含菌液，不含药物)和阴性对照孔(只含培养基，不含菌液)，置于35 ℃恒温培养箱中培养16～24 h，读取结果。试验重复3次，药敏结果根据美国临床实验室标准化研究所CLSI标准进行判定。

1.5头孢喹肟在血清中的静态杀菌动力学曲线取1 mL空白血清稀释的抗菌药液，将处于对数生长期的细菌原液用空白血清稀释到1×106CFU/mL后，取1 mL加到已知浓度抗菌药的TSB肉汤和血清中，制得药物浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 MIC和菌液终浓度约为5×107CFU/mL。置于37 ℃恒温培养箱中培养，然后分别在孵育0、2、4、6、8、12和24 h后进行菌落计数。

1.6给药和采样5头健康猪采用静脉注射1 mg/kg的头孢喹肟，5头健康猪肌内注射1 mg/kg头孢喹肟，在给药前和给药后5、15、30、45 min及1、2、3、4、6、8、12、24 h采集前腔静脉血样5 mL置于不含抗凝剂的塑料离心管中，室温静置30 min并避免阳光照射，随后在4 ℃冰箱中放置2 h，以加速血块凝缩，然后在4 ℃下4 000 r/min 离心10 min，分离血清。血清样品分装成2份，保存于-80 ℃下，一份用于药物浓度检测，另一份用于药效学试验。

1.7头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌的半体内药效学研究将采集的空白血清和给药后不同时段采集的样品解冻后，使用孔径0.22 μm的灭菌针式滤器过滤除菌，取适量除菌血清加入对数期的胸膜肺炎放线杆菌悬液，使血清样品中胸膜肺炎放线杆菌的最终浊度为5×106CFU/mL左右，置于37 ℃恒温培养箱中培养，分别于培养后0、2、4、6、8、12和24 h，采用平板菌落计数确定血清中活菌数。

1.8数据处理药动学数据采用WinNonlin 5.2药动学软件(Pharsight Corporation，Mountain view，CA，USA)进行分析。组织液中药物浓度-时间数据采用非房室模型进行处理，用梯形积分法计算药时曲线下面积(AUC)；每次给药后的药物峰浓度(Cmax)从拟合出的药时曲线中直接读取；药物浓度大于MIC的时间占给药间隔的百分比，是通过结合MIC对组织液中药物浓度进行分析后计算得到的。

以细菌变化量(E)为纵坐标，分别以PK/PD指数%T>MIC、Cmax/MIC及AUC/MIC为横坐标，选用WinNonlin中合适的药效学模型对3组数据进行拟合后，根据相关性得到用于预测抗菌效应的最佳PK/PD指数。

运用WinNonlin软件中的抑制性SigmoidEmax模型对头孢喹肟的抗菌效应与PK/PD指数的关系进行分析，模型方程式为：

(1)

式(1)中，E为抗菌效应，是24 h内细菌数量的变化值，即△lgCFU/mL；Emax为不含药对照组中细菌量的变化值；E0为药物与细菌作用24 h，药物产生最大抗菌效应时的细菌变化量；Ce为PK/PD指数，包括%T>MIC、AUC/MIC和Cmax/MIC；EC50为药物产生最大抗菌效应的50%所需的PK/PD指数值；N为Hill系数，表示PK/PD指数作用的药效曲线的斜率。

临床给药剂量可以整合猪体内药动学参数和体外抗菌试验的结果，并结合抑制型SigmoidEmax模型拟合的 Ex-vivo AUC0-24/MIC 值，获得不同抗菌效果需要的日给药剂量，计算公式[7]如下：

(2)

式(2)中，Dose(per day)为日给药剂量；(AUC/MIC)breakpoint为产生不同抗菌效应所需的 Ex-vivo AUC/MIC 临界点；MIC90为抑制受试细菌群体90%的菌株所需的 MIC；CLper hour为给药后每小时的体清除率；fu为猪血清中的游离药物分数；F为头孢喹肟的绝对生物利用度。

2 结果与分析

2.1胸膜肺炎放线杆菌在肉汤和血清中的MIC和MBC根据美国临床实验室标准化研究所CLSI标准，可知头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌在肉汤和血清中的MIC值均为 0.02 μg/mL，MBC值均为0.032 μg/mL。

2.2静脉注射和肌内注射给药后头孢喹肟在猪体内的药物浓度猪单剂量(1 mg/kg )静脉注射和肌内注射给药后，头孢喹肟在猪血清的药物浓度-时间数据采用WinNolin 5.2.1 药动学软件提供的非房室模型进行处理。药物浓度-时间曲线见图1。从图1可以看出，组织液中药物浓度在0.5 h左右达到峰值，在体内的消除半衰期更长。

图1 单剂量(1 mg/kg)静脉注射和肌内注射头孢喹肟后猪的药时曲线Fig.1 The drug concentration-time curve of pig after single dose (1 mg/kg)of cefquinome by intravenous injection and intramuscular injection

2.3头孢喹肟在体内的药动学参数通过静脉注射和肌内注射头孢喹肟(1 mg/kg)所测得的药动学数据分别符合二室模型和一级吸收二室模型，具体药动学参数见表1。血清中药物浓度与时间的关系式如下：C=Ae-αt+Be-βt，C=Ae-αt+Be-βt-(A+B)e-kat。

表1静脉注射和肌内注射头孢喹肟(1mg/kg)后血清中的药动学参数

Table1Thepharmacokineticparametersintheserumaftersingledose(1mg/kg)ofcefquinomebyintravenousinjectionandintramuscularinjection

注射方式InjectionmethodsA∥mg/Lα∥h-1B∥mg/Lβ∥h-1Ka∥h-1V∥L/kg静脉注射Intravenousinjection3．61±0．589．25±1．272．17±0．380．62±0．080．25±0．09肌内注射Intramuscularinjection1．83±0．511．21±0．430．83±0．210．42±0．0913．21±2．780．46±0．07注射方式Injectionmethodst1/2α∥/ht1/2β∥ht1/2Ka∥hK10∥h-1K12∥h-1K21∥h-1静脉注射Intravenousinjection0．16±0．041．52±0．433．35±0．874．87±1．533．23±0．81肌内注射Intramuscularinjection0．78±0．252．76±0．460．08±0．020．58±0．210．55±0．090．21±0．04注射方式InjectionmethodsCL∥L/(kg·h)Cmax∥μg/mLTmax∥hAUC0～24∥(μg·h)/mLF∥%静脉注射Intravenousinjection0．28±0．07肌内注射Intramuscularinjection0．24±0．030．237±0．0560．31±0．083．8±0．68104．57±11．28

2.4头孢喹肟在血清中的静态杀菌动力学曲线从图2可以看出，头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌具有明显的抗菌活性，并且随着药物浓度的增加，头孢喹肟的抗菌效应增强。在血清中，经过2 h的培养，菌液浓度已呈梯度性变化，0.5 MIC时无明显的抑菌效应，1.0 MIC时对细菌的生长有抑制作用，当浓度大于2.0 MIC时呈现杀菌效应，并且浓度越大，杀菌速率越快；当浓度超过4.0 MIC时，细菌数量下降幅度不大。

图2 头孢喹肟在血清中对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌效应Fig.2 The antibacterial effect of cefquinome in the serum on Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro

2.5半体内模型中头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌效应肌内注射和静脉注射头孢喹肟(1 mg/kg)后，在11个时间点采集的猪血清中头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌的半体内抗菌效应分别见图3和图4。从图3和图4可以看出，肌肉注射后，在0～6 h内采集的血清样品能够达到清除效应作用(细菌浓度下降1×104CFU/mL)；8 h采集的血清样品，可达到杀菌效应(细菌浓度下降1×103CFU/mL)；12 h后细菌数量低于检测限。12 h采集的血清样品可达到抑菌作用。静注后，在0～8 h内采集的血清样品均具有清除效应。12 h后，细菌数量低于检测限。12 h采集的血清样品，可达到抑菌作用。

图3 肌内注射头孢喹肟(1 mg/kg)后体外24 h杀菌曲线Fig.3 The bactericidal curve in vitro after intramuscular injection of 1 mg/kg cefquinome 24 h

图4 静脉注射头孢喹肟(1 mg/kg)后体外24 h杀菌曲线Fig.4 The bactericidal curve in vitro after intravenous injection of 1 mg/kg cefquinome 24 h

2.6头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD关系头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD指数之间的关系见图5。由图5可知，血清中PK/PD指数AUC0-24/MIC和Cmax/MIC与细菌变化量E的拟合效果均良好。由相关系数R2可知，AUC0-24/MIC (R2=0.9967)是预测头孢喹肟的抗菌效应最合适的PK/PD指数。分别产生抑菌、抗菌和清除的效应时，相对应的AUC0-24/MIC分别为116.0、175.5和218.5。

图5 PK/PD参数与细菌变化量(E)的关系Fig.5 The relationship between PK/PD parameters and variable quantity of bacteria

3 讨论与结论

目前，头孢喹肟的药动学数据已经在猪、牛[8]等动物体内进行了研究。该试验结果表明，肌内注射硫酸头孢喹肟符合一级吸收二室模型，其主要的药动学参数如下：血药达峰时间(Tmax)为0.31 h，峰浓度(Cmax)为0.237 μg/mL，t1/2β为2.76 h，AUC0-24为3.8(μg·h)/mL 与杨大伟等[9]研究结果相一致。但是，该试验测得的药动学数据与刘利锋等[10]的数据存在差异，这可能是由于动物的大小或者头孢喹肟的生产厂家的工艺的不同造成的。

测定在不同培养介质的条件下，药物对细菌体外的MIC和MBC值，对研究药动/药效学同步模型具有重要的意义。Shan等[11]研究发现在不同的基质中，能够引起MIC和MBC不一致，结果表明头孢喹肟在血清、组织液和炎症渗出液对多杀性巴氏杆菌的MIC和MBC比MH肉汤中高 3 倍左右。Zhang等[12]研究发现头孢喹肟在MHB和血清中对大肠杆菌的MIC值分别为 0.030和0.032 μg/mL，MBC值分别为0.060和0.064 μg/mL，基质效应无明显差异。该试验通过测定头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌在肉汤和血清中的MIC和MBC，结果发现无论在肉汤还是血清中，头孢喹肟对胸膜肺炎放线杆菌均具有相同的抗菌活性。这些研究结果对于治疗胸膜肺炎放线杆菌有着一定的指导作用。但是，如果测定体内的MIC和MBC,可能会对临床具有更合理的指导作用。

半体内PK/PD模型属于PK/PD 研究的一种有效方法，可为临床疾病的治疗提供一定的合理建议。头孢喹肟属于时间依赖性药物，其最有预测效果的 PK/PD 的参数是%T>MIC[13]，但是由于在半体内研究中药物的浓度是恒定不变的，因此，获得%T>MIC的意义不大。因此 选择测定AUC0-24/MIC 来拟合数据。该试验结果表明，当AUC0-24/MIC达到116.0、175.5和218.5时，细菌变化量E分别下降2 lgCFU/mL、3 lgCFU/mL和4 lgCFU/mL。参考上述公式，细菌变化量E下降2 lg CFU/mL、3 lg CFU/mL和4 lg CFU/mL所需每天的给药剂量分别为0.56、0.84和1.0 mg/kg。因此，当颈部肌内注射硫酸头孢喹肟(1.0 mg/kg)，可达到清除细菌的效果。

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