杂交鲟腹水症的病理学诊断

2018-05-02黄小丽汪开毓

四川农业大学学报 2018年1期

黄小丽，冯杨，成霞，汪开毓

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川农业大学动物医学院，成都 611130）

杂交鲟（hybrid sturgeon），属鲟形目（Acipenseriformes）、鲟科（Acipenseridae）、鲟属（Acipenser）。养殖杂交鲟主要是施氏鲟（Acipenser schrencki）、西伯利亚鲟（Acipenser baeri）和俄罗斯鲟（ipenser guldenstadti）的杂交后代[1]，也有的为施氏鲟与东北鳇鱼（Huso dauricus）或施氏鲟和西伯利亚鲟的杂交后代。杂交鲟因适应性强、生长速度快、性成熟早、后代可育、遗传性状较稳定等特点，已成为深受欢迎的鲟养殖品种。但是随着中国鲟工厂化、高密度化养殖，各种疾病频频发生，卵霉病、败血病、肿嘴病、锥虫病、小瓜虫病（又称白点病）、气泡病和腹水症等疾病的发生严重影响了鲟产业的发展[2]。

腹水症是以腹水为主要临床特征的一大类鱼类疾病的总称。可在包括黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）[3]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[4]和鲟（Acipensers）[5]等在内的多种水生动物上出现。该病多发生在高温季节，可引起鲟大批量死亡。病鱼临床症状主要表现为独游、浮游、无力、停食、腹部膨胀；解剖病鱼可见腹腔内积有大量淡黄色或清亮透明的腹水。多种因素均可引起鱼类腹水症，包括细菌性因素，如嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）[6]、拟态弧菌（Vibrio mimicus）[7]；病毒性因素，如呼肠弧病毒（CCV）[8]、Sorimachi[9]；寄生虫性因素，如隐鞭虫（Cryptobia）[10]、艾美球虫（Eimeria）[9]；营养性因素，如维生素E缺乏[11]；其他因素，如土霉素不合理长期使用，严重时可引起腹水[12]等。2015年四川某鲟养殖场养殖的杂交鲟（施氏鲟♂×西伯利亚鲟♀）出现腹水的症状。该养殖场共有杂交鲟4万余尾，患病杂交鲟体长10～15 cm，送样时已有半月的发病期，开始时每日死亡20～30尾，至送样时已达每日200尾左右，每天死亡率约为1.5%。发病后养殖户采用1 g/kg的恩诺沙星混合1.5 g/kg的氟苯尼考拌料喂，未见明显疗效。病鱼临床症状主要表现为独游、游动无力、食欲降低或停食、张口呼吸等。本次研究采用临床诊断、病原学、病理学对该病病因进行分析，以期为类似疾病的防控提供参考借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验动物

患病濒死杂交鲟4尾（10～15 cm），来自四川某鲟养殖场，具有典型腹腔积水症状，用于剖检观察、病料采集和病原菌分离。

1.2 剖检观察

用MS-222将送检鱼麻醉后用于剖检。首先检查病鱼体表完整性及其他体表症状，同时取少量鳃丝、体表黏液于载玻片上,压片后显微镜下观察有无寄生虫。之后打开口咽腔、围心腔、腹腔,依次观察各体腔黏膜情况及各内脏器官大体病理表现。最后取肠道内容物压片，观察有无寄生虫感染。

1.3 细菌学检查

利用75%的乙醇体表消毒后，在无菌条件下分别从送检鱼的肝脏、脾脏、肾脏中用铂金环接种细菌至BHI琼脂培养基。分别于15℃和25℃下恒温培养，连续观察1周，确定细菌的生长情况。

1.4 病毒学检测

选取病变明显的脾脏和肝脏组织，各取一小块进行混合匀浆，滤菌后加入含青、链霉素的Hanks液，12000r/min，离心5min后取上清液作为接种物接种胖头鲤肌肉细胞系（FHM），25℃培养7后观察细胞病变。

1.5 病理学检查

分别采取患病鱼的鳃、体侧肌肉、心、肝、肾、脾、脑、胃、肠道、鳔、眼睛等组织，用10%的中性甲醛固定，石蜡包埋，常规切片（5 μm），H·E 染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察病理损伤，并照相记录。对H·E染色下病变明显的组织，用油镜观察细菌形态。

2 结果与分析

2.1 病史及临床症状

患病杂交鲟为池塘养殖模式下人工养殖的商品鱼，体长10～15 cm。病鱼临床症状主要表现为病鱼摄食减少或者停食，鱼体消瘦，游动缓慢、无力，常独自弋游在水面或垂直悬浮于水面，对外界刺激反应迟钝，呼吸困难，有的明显可见腹部膨胀，积有腹水，侧翻或腹部上翻，张口呼吸。发病水温为25℃。发病后曾投喂恩诺沙星、氟苯尼考，未见明显疗效。

2.2 尸检及病理学观察

图1 患病杂交鲟腹腔积水及实质器官大体病变Figure 1 Ascites and gross pathology of diseased hybrid sturgeon

患病杂交鲟主要表现为腹部膨胀。剖解后在腹部发现大量清亮腹水（见图1A）；脾脏苍白，表面可见大小不一出血斑；肝脏发白（见图1B），有直径2～3 mm的出血点。消化道无食物，其他脏器眼观病变不明显。鳃丝、黏液及肠道内容物压片中未见明显寄生虫。

2.3 细菌学检测

在无菌条件下利用接种环从病鱼的脾脏、肝脏、肾脏中接种细菌至BHI培养基，15℃和25℃恒温培养1 w后，未见明显细菌生长。

2.4 病毒学检测

组织匀浆上清液，过滤除菌后接种到FHM细胞系，25℃培养7 d后，未观察到细胞病变。

2.5 组织病理学检查

经石蜡切片，H·E染色后观察发现，该病靶器官主要出现在脾脏、肝脏、头肾和体肾。此外，还可见轻微的心肌炎。肌肉、脑、眼睛、鳔等未见明显病变。

脾脏主要表现为大面积充血，出现多灶性坏死（见图2A），坏死灶内细胞破裂，细胞核裂解、胞质融合，且有许多炎性细胞分布，形成许多无结构区域（见图2B）。油镜下可见细胞中有成簇状生长的短杆状细菌（见图2C）。

肝脏主要病变为结构紊乱，肝索消失，低倍镜下可见许多区域弥漫性出血，大量红细胞散在分布（见图2D）。高倍镜下可见肝实质细胞溶解、破裂，结构消失，呈现大面积无结构区域（见图2E）。肝静脉及血窦中蓄积了大量炎性细胞。油镜下可见坏死灶细胞内有大量呈簇状分布的杆菌（见图2F）。

头肾及体肾主要表现为肾间质性肾炎。头肾组织颜色不均，大面积区域褪色（见图2J），褪色灶内有大量的炎症细胞（见图2K）。此外，体肾造血组织坏死，细胞崩解、破碎，细胞核浓缩深染，坏死组织内大量炎性细胞浸润，肾小囊及血窦扩张（见图2I）。

肠表现为肠绒毛部分坏死脱落，黏膜下层水肿，肠上皮细胞坏死脱落，固有层裸露（见图2G），毛细血管充血并可见炎性细胞浸润（见图2H）。浆膜层水肿增厚，伴有炎性浸润，油镜下固有层和黏膜下层可见少量细菌。此外，心脏表现为轻微心肌炎，心肌小部分区域存在炎性浸润现象（见图2L）

2.6 病因分析

经尸检发现，病变主要在腹腔实质器官内，以脾脏和肝脏的病变最为明显。病鱼鳃丝、黏液及肠道内容物压片中未见明显寄生虫，可排除寄生虫致病因素；采集病变器官进行病毒分离培养，未见细胞病变，可基本排除病毒性致病因素；对病鱼的各组织器官病理学分析发现，脾脏和肝脏损伤明显，油镜下可见脾脏、肝脏、肾脏和肠道有大量呈簇状生长的短杆状细菌。从细菌学角度来看，虽然BHI培养基并没有分离出病原性细菌，但组织切片的观察中，病灶中均发现大量待确定具体种类的杆状细菌。故综上检测结果，判定此次杂交鲟腹水综合征可能是由某种杆菌感染引起。

3 讨论

腹水，即腹腔内蓄积大量液体成分，它不是独立的疾病，而是伴随与诸多病因的一种病征。导致其发生的主要有以下几种病因：①心源性腹水：出现于能造成充血性心力衰竭的各种疾病，使静脉系统淤血，体腔积液；②稀血性腹水：出现于能造成血液稀薄和胶体渗透压明显降低的疾病，如慢性贫血或低蛋白血症等，使蛋白丢失过多和体液存留而致发本病；③瘀血性腹水：出现于能造成门静脉系统淤血的各种疾病，如肝硬化、肝坏死等，因静脉压升高血行受阻，毛细血管内液体渗出而发生腹水[13]。此次实验中病鱼有明显的肝脏病变、脾脏病变，轻微的心脏病变，因此肝脏出血坏死导致门脉系统高压，血液回心受阻引起的腹腔内积液可能性较大。

对于养殖鱼类腹水症的发生原因，国内外学者都进行了广泛研究。目前发现的致病因素包括细菌性因素，如气单胞菌类感染[14]；病毒性因素，如鱼腹水病毒（YAV）感染[15]；寄生虫因素，如吸虫纲的某些寄生虫感染[16-17]。此外，营养不良，微量元素缺乏等也可以继发腹水症状。此次实验中，运用病原菌分离培养技术虽然未能分离到目标菌株，但在组织病理学观察中，在肝脏、脾脏、肾脏、肠道等多个组织器官均发现大量细菌，可基本推测本病是一种细菌性疾病。至于未能成功分离到细菌可能原因有：其一，该细菌生长或对营养要求高或需其他特殊条件，在常规培养基上无法生长；其二，该细菌寄生于器官细胞内，不易分离培养，而本实验亦未进行组织捣碎研磨涂抹培养。

此次在杂交鲟病灶部位发现大量细长、棒杆状、胞内成簇状生长的细菌。水产上呈簇状的杆菌主要有柱状黄杆菌[18]、溶藻弧菌[19]、和副溶血弧菌[20]等几个种类。此次实验中的致病菌具体是哪种细菌有待进一步鉴定。目前，针对胞内菌感染的药物不多，可供选择的有酰胺醇类，如氟苯尼考；四环素类，如多西环素等。

图2 患病杂交鲟组织病理学表现.Figure 2 Histopathological manifestations of diseased hybrid sturgeon

鱼类腹水症在许多疾病上均有表现，因此仅根据临床症状难以确诊，需借助其他特殊诊断法。病理学诊断方法与其他方法相比，具有切片制作简单，所需器材常见，耗时短的特点。通过显微镜观察，不仅可以直观观察到组织病变情况，快速确定被攻击的靶器官，明确机体病变情况，而且可以直接观察到细菌、寄生虫、真菌等部分病原，明确疾病种类，防止操作失误导致的误诊，弥补分离培养技术和分子生物学技术易受多种条件影响的这一不足，为下一步确诊和治疗指明方向。

参考文献：

[1]王小亮，徐立蒲，王静波，等.杂交鲟海豚链球菌的分离、鉴定及药物敏感性[J].微生物学报，2014，54（4）：442-448.

[2]潘连德.养殖鲟鱼非寄生性疾病的诊断与控制[J].淡水渔业，2000，30（6）：36-38.

[3]丁正峰，薛晖，边文冀，等.养殖黄颡鱼腹水症病原研究[J].华中农业大学学报，2008，27（5）：639-643.

[4]孙玉华，丁军.大菱鲆工厂化养殖常见疾病防治技术[J].中国水产，2015（12）：84-85.

[5]罗钦，陈玉坤，饶秋华，等.鲟鱼腹水综合症疾病诊断及防治技术[J].福建农业科技，2014，45（7）：46-47.

[6]钟妮娜，汪开毓，罗碧平，等.斑点叉尾鮰“腹水症”病原分离及免疫研究[J].中国兽医杂志，2002，38（9）：40-41.

[7]张传亮.拟态弧菌外毒素的检测及中草药抑菌抗毒素活性的研究[D].合肥：安徽农业大学，2007.

[8]钟妮娜，汪开毓，罗碧平，等.斑点叉尾鮰疑似疱疹病毒感染的病理形态学观察[J].中国兽医杂志，2002，38（9）：40-41.

[9]战文斌.水产动物病害学[M].北京：中国农业大学出版社，2004.

[10]PATRICK T K W.鲑鱼隐鞭虫病及其防治策略[J].动物学报：英文版，2005，51（4）：546-549.

[11]汪开毓，周震，耿毅.鲤维生素E缺乏的病理学研究[J].水生生物学报，2007，31（3）：354-362.