南江黄羊ARHGAP11A基因SNPs筛选及其与生长性状的关联分析

王嘉欣，张德鹏，谭永乾，冯 静，宋天增，陈 愉，张红平，李 利*

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川农业大学动物医学院，成都 611130；3.西藏自治区农牧科学院，拉萨 850000；4.四川南江黄羊原种场，四川南江 635600）

ARHGAP11A（Rho GTPase-activating protein 11A）基因，也被称为 KIAA0013 或 MGC70740，属于RhoGTPs（Rho GTPase-activating proteins）酶激活蛋白的一员，与细胞内信号分子Rho GTPases的调控息息相关[1]。RhoGAPs结合Rho GTPases在包括能动性、收缩性、生长、分化等细胞进程中至关重要[2-3]。

ARHGAP11A通过Rho GTPase和GPCR（G protein coupled receptor）信号通路参与激活GTPase活动，从而间接控制细胞的生物学功能，包括细胞的形态、扩散、迁移、内吞以及细胞周期进程[4]。在哺乳动物癌细胞中发现，ARHGAP11A诱导Rac1的活性从而抑制RhoA的相对增强是癌细胞迁移和侵袭的关键[5]。在有丝分裂中ARHGAP11A基因沉默则会导致有丝分裂细胞膜起泡，RhoA的激活速率增强[6]。因此，ARHGAP11A表达水平影响细胞的增殖和凋亡[1]，但目前关于ARHGAP11A基因在家畜上的研究未见报道。

南江黄羊是我国培育的第一个肉用山羊品种，具有体格高大，生长发育快，四季发情，繁殖率高，抗病力强，采食性好，适宜粗放饲养等特点[7]。同时，南江黄羊骨骼肌卫星细胞（SMSCs）具有突出的增殖和融合率能力[8]。因此，本试验采用PCR产物直接测序法，检测南江黄羊ARHGAP11A基因外显子及非编码区域的单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）位点，并将这些位点与其生长性状进行关联分析，以期筛选出对南江黄羊生长性状有显著影响的多态位点，为南江黄羊的分子育种提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物和血样采集

试验中南江黄羊母羊群体（n=243）均来自南江黄羊原种场。所有羊只在同一环境条件下进行相同的饲养管理。羊群饲养方式为放牧加适当补饲，饲料营养水平满足羊生长需求。

每一只试验羊颈静脉采集全血1.5mL，加入肝素钠抗凝，-20℃冰箱中保存以备基因组DNA提取。

1.2 南江黄羊生产性能测定

按照常规方法分别测定南江黄羊的初生重（birth weight，BWT）以及 2月龄、6月龄、12月龄及24月龄共 4个生长阶段的体重（weight，WT）、体长（body length，BL）、体高（body height，BH）和胸围（chest circumference，CC）。

1.3 引物设计

为了扩增山羊ARHGAP11A基因的12个外显子以及部分非编码区，根据NCBI数据库中公布的山羊基因组序列以及预测的ARHGAP11A mRNA（XM_005685462.3），采用Primer Premier 5.0软件设计了14对引物（见表1）并用Oligo 6.0和Blast验证其特异性。引物由成都擎科生物公司合成。

1.4 基因组DNA的提取及DNA的质量检测

采用常规血液基因组提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取山羊基因组DNA后，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳并在凝胶图像分析仪BIO-RAD ChemDOC XRS中紫外成像，用Quality One 4.6.2软件分析图像以判定DNA完整性。DNA的纯度与浓度利用核酸蛋白检测仪（BIO-RAD，USA）测定。对符合要求的样品-20℃保存备用。

1.5 目标片段的PCR扩增和测序

以获得的山羊基因组DNA为模板，根据PCR扩增总体系（2×Master Mix Taq 酶 15.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，灭菌dd H2O 12.0 μL）和PCR程序（95℃预变性 5 min，然后38个循环（95℃变性30s，各引物特异性Tm 30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min）进行扩增后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选取目的条带亮且无杂带的PCR产物送至深圳华大基因科技服务有限公司进行双向测序。

1.6 数据分析

将测序结果进行核对、组装以确定ARHGAP11A基因的 CDS区和 UTR；利用 RegRNA 2.0（http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）分析序列上的调控元件。用Sequencher 4.7软件比对各SNPs，在线进行群体中SNPs位点的基因型频率和基因频率以及Hardy-Weinberg 检验（http：//www.oege.org/software/hardyweinberg.html）。通过PHASE 2.1.1进行单倍型构建，Haploview 4.2进行连锁不平衡分析。

表1 PCR扩增山羊ARHGAP11A基因序列的引物信息Table 1 Primers'information in amplifying goat ARHGAP11A

南江黄羊体重体尺性状与SNPs关联分析利用SAS（19.0）软件中的一般线性模型进行。分析模型为：Yijkl=μ+Gk+eijkl，其中 Yijkl为个体性状的观测值，μ为群体均值，Gk为基因型效应，eijkl为随机误差。结果以平均值±标准差表示。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 山羊ARHGAP11A基因序列及其与其他物种的比较分析

基于NCBI中预测的山羊ARHGAP11A mRNA序列（XM_005685462.3），利用14个测序片段组装获得山羊ARHGAP11A基因序列4235bp，其中CDS序列全长3 069 bp，其余为5′UTR和3′UTR的部分序列（分别 486 bp和680 bp）。将山羊ARHGAP11A基因核苷酸序列与小鼠（NM_181416.3）、绵羊（XM_004010425.3）、牛（XM_870134.6）、人（NM_014783.5）和豚鼠（XM_003475662.2）的进行分析，发现物种之间相似性达到78%以上。其中，山羊与绵羊的相似性最高（99%），其次是与牛（97%）（见图1）。利用预测出的ARHGAP11A氨基酸序列进行对比也发现物种间ARHGAP11A蛋白高度相似，尤其是绵羊、山羊和牛这3种反刍动物。这些说明ARHGAP11A基因在物种之间高度保守，暗示其在个体发育中的可能具有重要作用（见图2）。

图1 物种间ARHGAP11A基因外显子序列相似性分析Figure 1 Sequence similarity of ARHGAP11A exons among species

2.2 南江黄羊群体中ARHGAP11A基因的SNP位点

在南江黄羊群体中共发现ARHGAP11A基因16个SNPs位点（见图3a）。其中1个突变（g.-340A＞G，以翻译起始为+1）位于 5′UTR，在 Exon 1中也只有 1个（g.39G＞C），其余 14个分别位于 Exon 12（7个 SNPs）和 3′UTR（7 个 SNPs）（见图 3b）。ARHGAP 11A基因编码区的8个 SNPs中有 3个SNPs（g.39G＞C，g.2565C＞T，g.3060T＞A）是同义突变，其余 5个 SNPs（g.2852T＞C，g.2856G＞A，g.2907G＞A，g.2912 G＞A，g.2950G＞A）为错义突变。对应的氨基酸改变如下：缬氨酸→丙氨酸（g.2852T＞C）、甲硫氨酸→异亮氨酸（3371C＞T）、甲硫氨酸→异亮氨酸（g.2907G＞A）、精氨酸→赖氨酸（g.2912G＞A）、缬氨酸→异亮氨酸（g.2950G＞A）。

图2 6个物种间预测的ARHGAP11A氨基酸序列对比Figure 2 Comparison of predicted amino acid sequence of ARHGAP11A among 6 species

利用在线软件 RegRNA 2.0（http：//regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）分析发现，ARHGAP11A具有包括myogenin（cagctg）以及 MEF2A（tatttttaaa）、MEF2C（tattttt）和MEF2D（aaaatag）在内的多个转录因子调控基序（Transcriptional regulatory motif，TRM）。有趣的是，在南江黄羊群体中发现的16个SNPs中7个位于转录调控元件内（见表2），其中既涉及内含子剪切增强子（intron splicing enhancer，ISE），如 g.-340A＞G和g.3155T＞C；也有外显子剪切增强子（exon splicing enhancer，ESE），如 g.3680 T＞C，而且 g.3680 T＞C 位点还涉及多聚腺苷化（Polyadenylation sites，PAS）。另外还有 4个位点（g.39G＞C、g.3060T＞A、g.3483A＞G和g.3525A＞G）均位于调控基序（见表2）。值得注意的是，南江黄羊群体中发现的7个与转录调控有关的SNPs中就有 3个（g.3483A＞G、g.3525A＞G、g.3680T＞C）集中在3′UTR端约200 bp的片段上。因此，后续重点分析这范围内的4个SNPs以及它们与南江黄羊生长发育的关系。

图3 南江黄羊羊ARHGAP11A基因突变位点测序峰图以及SNPs在ARHGAP11A基因中位置Figure 3 Mutation sites of ARHGAP11A gene in Nanjiang Yellow goats and their schematic locations

南江黄羊群体ARHGAP11A基因中g.3483A＞G、g.3525A＞G、g.3621G＞A 和 g.3680T＞C 这 4 个位点优势等位基因的频率范围为0.525（g.3525A＞G）到0.996（g.3680T＞C），各位点的观测杂合度和期望杂合度分别介于0.005-0.451和0.499-0.003之间（见表3）。除了g.3525A＞G以外，其余3个位点（g.3483A＞G，g.3621G＞A 和 g.3680T＞C） 处于 Hardy-Weinberg不平衡状态（P＜0.01），暗示群体中这 3个位点可能受到选择的影响。利用这4个位点构建获得4种单倍型，其中AAGT与AGGT占绝对优势，频率分别为0.514和0.467（见图4a），并且这4个SNPs位点存在一定程度的连锁不平衡，尤其是g.3483A＞G 与g.3680T＞C之间（见图4b）。

表2 南江黄羊群体中ARHGAP11A基因16个SNP的基因型及相关调控元件Table 2 Genotypes of 16 mutations and related regulatory motifs in ARHGAP11A gene of Nanjiang Yellow goats

表3 南江黄羊群体中ARHGAP11A基因4个SNP的基因分型检测结果Table 3 Genotypes of 4 SNPs in ARHGAP11A gene of Nanjiang Yellow goats

2.3 南江黄羊群体ARHGAP11A基因与生长发育性状的关联分析

由于群体中只有1个个体在g.3680 T＞C位点突变（CC型，其余为野生型TT），因此本研究进一步分析了3个SNPs（g.3483A＞G、g.3525A＞G和g.3621G＞A）与南江黄羊不同生长阶段体重、体高、体长、胸围等指标之间关系（见表4）。结果发现，g.3483A＞G和g.3621 G＞A上纯合突变个体（分别为GG型和AA型）具有2周岁前体重高于野生型（分别为AA型和GG型）个体的趋势（P＞0.05）。在g.3525 A＞G位点，AG型个体不同阶段的体重、体尺指标均高于GG型和AA型个体，且BWT、WT-12和CC-12与突变型GG个体差异显著（P＜0.05），但与AA个体之间差异不显著（P＞0.05）。进一步分析发现 g.3483A＞G、g.3525A＞G、g.3621G＞A 和 g.3680T＞C 位点构建的 3种单倍型中（频率小于1%的单倍型GGAC未分析），具有AAGT单倍型个体的体重体尺指标值最高，GGAT型个体的最低，尤其是6月龄和12月龄平均体重两者相差多达2.5 kg以上，但两者差异不显著（P＞0.05）（见表4）。总的来看，无论从单SNP位点还是联合的单倍型，所分析的ARHGAP11A基因突变均不同程度影响南江黄羊的体重体尺指标。

图4 南江黄羊群体中ARHGAP11A 基因4个SNP 的单倍型构建和连锁不平衡分析Figure 4 Haplotype construct and linkage disequilibrium analysis of 4 SNPs in ARHGAP11A gene in Nanjiang Yellow goats

3 讨论

表4 南江黄羊ARHGAP11A基因多态性位点对其生长性状的影响Table 4 Effect of ARHGAP11A polymorphisms on growth traits in Nangjiang Yellow goats

本实验测序组装得到ARHGAP11A基因包含外显子和部分UTR的片段（4 235 bp），其中CDS区3 069 bp。对CDS以及预测的氨基酸序列比对均发现小鼠、绵羊、山羊、牛、人和豚鼠间ARHGAP11A基因高度保守。另外，ARHGAP11A基因还可能受到转录因子 myogenin以及MEF2家族中MEF2A、MEF2C和MEF2D的调控。作为肌肉特异性的转录因子，myogenin主要参与骨骼肌的发育和修复[9]，而肌肉组织约占哺乳动物机体重量的40%～50%。MEF2家族基因则广泛参与动物组织器官的生长发育[10]。同时，ARHGAP11A通过Rho GTPases和GPCR信号通路参与调控众多信号转导途径，从而间接控制细胞的生物学功能如细胞周期进程[4]。这些结果暗示，在进化上高度保守的ARHGAP11A基因与动物生长发育的密切相关。

续表

基因突变与畜禽生长发育性状密切关联，从而常作为畜禽育种的分子标记以大幅度提高育种效率[11-13]。最为著名的是myostatin基因（也称为GDF8基因），其SNP位点显著影响夏洛莱肉羊的肌肉深度[14]以及新西兰罗姆尼羊的胴体重[15]。在南江黄羊ARHGAP11A基因4 235 bp上发现16个SNPs，其中14个集中在最后一个外显子（Exon 12；7个）和3′UTR（7个），并且位于转录调控元件内的7个SNPs中有 4个（g.3155T＞C、g.3483A＞G、g.3525A＞G和 g.3680T＞C）在 3′UTR。大量研究表明，3′UTR 与mRNA在细胞核外的转运、翻译效率、稳定性及亚细胞定位紧密相关[16]。该区域的变异会对目标基因功能的发挥产生一定程度的影响，如肉牛ANGPTL4基因的3′UTR SNPs位点与肉用性能显著相关[17]。本研究在南江黄羊群体中分析了3个3′UTR内的SNPs（g.3483A＞G、g.3525A＞G 和 g.3621G＞A），发现它们均与南江黄羊的体重体尺性状密切相关。其中，在g.3483A＞G和g.3621 G＞A位点纯合突变个体体重（2、6和12月龄）高于野生型。在g.3525 A＞G位点，AG型个体不同阶段的体重体尺指标均高于GG型和AA型个体。

值得注意的是，在南江黄羊群体ARHGAP11A基因上发现7个SNPs位于转录调控元件基序内，如g.3483A＞G与g.3525A＞G分别位于转录激活因子 IPF1（pancreatic and duodenal homeobox 1，也称为 PDX1）和 OC-2（one cut homeobox 2）的基序内。IPF1主要涉及能量代谢和肝脏发育，并且与FOXO1（forkhead box O1）具有互作[18]，而 g.3060T＞A 位于FOXO1基序内，OC-2则结合在RNA聚合酶II核心增强子区域参与基因激活[19]。另外，ARHGAP11A基因在CDS区中发现的5个错义突变SNPs位点可直接改变氨基酸序列。因此，在ARHGAP11A基因突变位点上，这些潜在转录因子的调控作用以及其CDS区内的SNP位点与南江黄羊生长发育的关系需进一步研究。

4 结论

实验测得山羊ARHGAP11A基因全长CDS（3 069 bp）序列和部分UTR。在南江黄羊ARHGAP11A基因外显子和UTR内检测到16个SNPs，主要分布于最后一个外显子（7个）和3′UTR区（7个）。3个3′UTR 内的突变 （g.3483A＞G、g.3525A＞G 和 g.3621G＞A）与 3种单倍型（AAGT、AGGT 和 GGAT）均与南江黄羊的体重、体尺性状密切相关。初步研究表明ARHGAP11A基因可作为南江黄羊生长发育性状的候选基因。

参考文献：

[1]JIE X，ZHOU X，WANG J，et al.RhoGAPs attenuate cell proliferation by direct interaction with p53 tetramerization domain[J].Cell Reports，2013，3（5）：1526.

[2]AMIN E，JAISWAL M，DEREWENDA U，et al.Deciphering the molecular and functional basis of RhoGAP family proteins：A systematic approach towards selective inactivation of Rho family proteins[J].Journal of Biological Chemistry，2016，291（39）：M116-M736967.

[3]JACOBS T，HALL C.Rho GAPs—Regulators of Rho GTPases and More[M].Dordrecht：Springer Netherlands，2005：93-112.

[4]ROMANOV V S，POSPELOV V A，POSPELOVA T V.Cyclindependent kinase inhibitor p21(Waf1)：contemporary view on its role in senescence and oncogenesis[J].Biochemistry Biokhimiia，2012，77（6）：575-584.

[5]KAGAWA Y，MATSUMOTO S，KAMIOKA Y，et al.Cell cycledependent Rho GTPase activity dynamically regulates cancer cell motility and invasion in vivo[J].Plos One，2013，8（12）：e83629.

[6]ZUO Y，OH W，FROST J A.Controlling the switches：Rho GTPase regulation during animal cell mitosis[J].Cellular Signalling，2014，26（12）：2998-3006.

[7]张红平，王维春，熊朝瑞，等.南江黄羊的种质特性[J].中国草食动物科学，2004（s1）：113-114.

[8]陈利.南江黄羊和波尔山羊骨骼肌卫星细胞增殖分化能力的比较[D].雅安：四川农业大学，2014.

[9]HASTY P，BRADLEY A，MORRIS J H，et al.Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene[J].Nature，1993，364（6437）：501.

[10]Potthoff M J，Olson E N.MEF2：a central regu-lator of diverse developmental programs[J].Development，2007，134（23）：4131-4140.

[11]CHANG M T，CHENG Y S，HUANG M C.A novel non-synonymous SNP of the COLX gene and its association with duck reproductive traits[J].Molecular&Cellular Probes，2012，26（5）：204-207.

[12]FAN B，DU Z Q，DANIELLEM G，et al.Development and application of high-density SNP arrays in genomic studies of domestic animals[J].Asian Australasian Journal of Animal Sciences，2010，23（7）：833-847.

[13]VIGNAL A，MILAN D，SANCRISTOBAL M，et al.A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics[J].Genetics Selection Evolution，2002，34（3）：1-31.

[14]HADJIPAVLOU G，MATIKA O，CLOP A，et al.Two single nucleotide polymorphisms in the myostatin(GDF8)gene have significant association with muscle depth of commercial Charollais sheep[J].Animal Genetics，2008，39（4）：346-353.

[15]HICKFORD J G H，FORREST R H，ZHOU H，et al.Polymorphisms in the ovine myostatin gene(MSTN)and their association with growth and carcass traits in New Zealand Romney sheep[J].Animal Genetics，2010，41（1）：64-72.

[16]MIGNONE F，GISSI C，LIUNI S，et al.Untranslated regions of mRNAs[J].Genome Biology，2002，3（3）：1-4.

[17]MA Y，LI R R，HOU F，et al.Comparative Mapping and 3'UTR SNP Detection of ANGPTL4 Gene in Beef Cattle[J].Journal of Animal&Veterinary Advances，2011，10（13）：1649-1655.

[18]ELBEIN S C，WANG X，KARIM M A，et al.Role of a proline insertion in the insulin promoter factor 1(IPF1)gene in African Americans with type 2 diabetes[J].Diabetes，2006，55（10）：2909-2914.

[19]JACQUEMIN P，LANNOY V J，ROUSSEAU G G，et al.OC-2，a novel mammalian member of the ONECUT class of homeodomain transcription factors whose function in liver partially overlaps with that of hepatocyte nuclear factor-6[J].Journal of Biological Chemistry，1999，274（5）：2665.