长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP1克隆和表达分析

杨 桦，苏 婷，杨 伟*，杨春平，周学莉，李一平

（四川农业大学林学院/四川省林业生态工程省级重点实验室，成都 611130；2.绵阳市林业局，四川绵阳 621000）

昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）是存在于触角感器淋巴液中的一类水溶性蛋白质，它与进入感器内的气味分子相结合，并携带脂溶性化合物穿过亲水的淋巴液，送到嗅觉神经末梢[1]。而昆虫信息素结合蛋白（pheromone binding proteins，PBPs）属于气味结合蛋白中的一种，它能特异的与信息素结合，在昆虫寻偶、交配等行为中起着关键作用[2]。存在于嗅觉感器腔内的信息素结合蛋白能识别并携带进入感器腔的特定信息素分子到达嗅觉神经元树突膜上的气味受体[3-4]。自从R.G.Vogt和L.M.Riddiford[5]在多音天蚕蛾Antheraea polyphemus雄虫触角中发现第一个PBPs以来，经众多学者的探索，陆续在鳞翅目Lepidoptera、蜚蠊目Blattodea、鞘翅目Coleoptera、膜翅目Hymenoptera等多个目几十种昆虫触角中发现PBPs，如蛀茎夜蛾Sesamia nonagrioides[6]、家蚕 Bombyx mori[7]、斜纹夜蛾 Spodoptera litura[8]、甜菜夜蛾 Spodoptera exigua[9]、马德拉蜚蠊Leucophea maderea[10]、黑腹果蝇Drosophilamelanogaster[11]、意大利蜜蜂 Apis mellifera[12]、古铜异丽金龟Anomala cuprea[13]和东方铜绿金龟Exomala orientalis[14]等，这些基因包括 PBP1、PBP2 和 PBP3，其编码的氨基酸序列同源性在32%～92%之间[15]。

长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti Guerin-Meneville，又名竹横锥大象，属鞘翅目Coleoptera象虫科Curculionidea弯颈象属Cyrtotrachelus，广泛分布于我国的四川、重庆、广西、广东、贵州、上海、江西等地以及越南、缅甸、泰国等东南亚国家[16-18]。长足大竹象寄主广泛，危害箣竹属Bambusa、绿竹属Dendrocalamopsis、牡竹属Dendrocalamus等28个竹种的竹笋，其幼虫尤其喜欢蛀食楠竹Phyllostachys pubescens、慈竹 Neosinocalamus affinis、青皮竹 Bambuusa textiles、撑蒿竹 Bambusa pervariabilis、绿竹 Bambusa oldhamii等丛生竹的竹笋，是一种幼虫生长速度快、隐蔽性强的蛀食性竹林害虫[19-20]。一年中有11个月生活在土壤中，在地上的1个月中，约15 d生活在竹笋内[21]。长足大竹象气味结合蛋白相关研究目前未见报道，因此，本研究依据长足大竹象转录组数据设计引物，克隆长足大竹PBPs基因，并采用定量PCR方法检测了该基因在不同虫态和雄虫不同组织中的表达水平，以期为进一步研究该基因的功能奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试虫源：在2016年7月中下旬和8月中旬长足大竹象成虫出土盛期和幼虫期，于四川省芦山县思延乡铜头村（102°91′N，30°13′E）慈竹林采集刚羽化出土未交配成虫与幼虫，逐头分装于筒形牙签盒内（直径5 cm，高10 cm）。带回实验室，对雌、雄成虫、幼虫（混合龄级）以及雄虫的触角、头部（去触角）、胸部、腹部、足分别收集后，立即放入液氮中快速冷冻，并置于-80℃冰箱中保存备用。

试剂：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、DNAmark DL2000，日本TaKaRa公司；Taq PCR MasterMix、大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞、氨苄青霉素、50×TAE缓冲液，天根生化科技（北京）有限公司；实时荧光定量试剂盒及其它相关试剂，宝生物工程（大连）有限公司。

仪器：ABI step one plus荧光定量PCR仪、NANODROP RNA质量检测仪，美国ABI公司；PTC200 PCR扩增仪、GelDocXR凝胶成像系统、电泳仪，美国伯乐（Bio-Rad）生命医学产品（美国）有限公司；DU800紫外分光光度计，BeckmanCoulter（美国）公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA第一链的合成

取长足大竹象雄成虫触角10对，液氮研磨后按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书提取触角总RNA，最后溶于50 μL去RNA降解酶水中，置于-80°C保存备用。

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit说明书操作流程，往 PCR 管中加入 2 μL 5×PrimeScript®Buffer、0.5 μL PrimeScript®RT Enzyme Mix I、0.5 μL Oligo dT Primer（50 μmol/L）、0.5 μLRandom6mers（100 μmol/L）、4.5 μL RNase Free dH2O，最后加入 2 μL total RNA。将上述混合物于PCR仪中逆转录合成第一链cDNA：37°C 保温 15 min，85 ℃失活 5 s，4 ℃保持，反转录产物置于-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增cDNA片段

根据长足大竹象转录组数据（GenBank登录号：SAMN06176790）设计特异性引物（表1）。PCR反应体系为 25 μL：1 μL 反转录第一链 cDNA、2 μL 上下游引物、9.5 μL ddH2O、12.5 μL Premix Taq。PCR 反应条件：94℃预变性4 min，94℃C变性30 s，41.3℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸7 min，4℃保持。精确吸取5 μL PCR产物，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，6×loading buffer染色，凝胶成像系统拍照。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 PBP基因的克隆

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0说明书的操作步骤进行胶回收，参照pMDTM19-T Vector说明书，配制10 μL 反应体系：1 μL pMDTM19-T Vector，2 μL 胶回收产物，2 μL ddH2O，5 μL SolutionⅠ。PCR仪里16℃反应30 min。连接产物采用热击法转化Escherichia.coli DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的固体培养基上培养过夜，经蓝白斑筛选，挑取8个白色单菌落进行菌落PCR（反应体系及条件同上）鉴定，鉴定为阳性克隆的样品送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.2.4 序列分析

将获得的序列在NCBI中进行BLAST同源性检索，利用ORF Finder查找开放阅读框。使用SignaIP进行信号肽预测，TMHMM进行跨膜区预测，ExPASy-ProtScale进行亲脂性分析，compute pI/Mw预测蛋白质的等电点及质量，并通过BLAST分析推导氨基酸序列。从NCBI查阅昆虫PBP氨基酸序列，通过Clustalx及MEGA 5.0建立系统进化树，采用Bootstrap值检验系统数的置信度，各重复1 000次。

1.2.5 长足大竹象CbuqPBP1基因的相对表达量分析

取雌、雄成虫、幼虫（混合龄级）以及成虫的触角、头部（去触角）、胸部、腹部、足各10 mg，分别提取总RNA，取2 μg RNA反转录获得cDNA，每个虫态和组织设3次重复。根据长足大竹象PBP基因（GenBank登录号：KU845733）设计特异性引物，并根据长足大竹象转录组数据（GenBank登录号：SAMN06176790）设计内参基因引物，每个样品重复3次（表1）。采用SYBR Green I染料法进行实时荧光定量 PCR，20 μL 反应体系为：2×YBR®Premix Ex Taq II 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各 1 μL、cDNA模板 1 μL、ddH2O 7 μL。反应条件为：95 ℃预变性40 s，95 ℃变性 10 s，57 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 20 s，45个循环。

1.3 数据分析

长足大竹象PBP基因的相对表达量采用2-ΔΔCT方法计算[22]。采用SPSS 20.0软件进行试验数据的统计分析，用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 长足大竹象CbuqPBP1基因序列分析

根据长足大竹象转录组结果设计引物，提取长足大竹象成虫触角总RNA，用紫外分光光度计测定所提取总RNA纯度，OD260/OD280为1.9，反转录为cDNA后，以长足大竹象触角的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到530 bp左右的特异性条带，基因长度与PBP/GOBP family相符。在NCBI上经BLAST分析，发现此序列与鞘翅目的金龟类昆虫PBPs一致性较高，证明获得的序列为长足大竹象性信息素结合蛋白基因命名为CbuqPBP1（GenBank登录号：KU845733.1）。

CbuqPBP1进行ORF预测，结果表明，CbuqPBP1基因包含1个长为432 bp的开放阅读框，编码143个氨基酸残基，其中前17个氨基酸残基为预测的信号肽，预测蛋白分子量为15.84 kDa，等电点为4.60，含有6个保守的半胱氨酸位点，具有昆虫PBP一级结构的典型特征，CbuqPBP1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列见图1。

图1 长足大竹象CbuqPBP1核苷酸序列及推导的氨基酸序列Figure 1 Nucleotide and putative amino acid sequences of CbuqPBP1 gene from Cyrtotrachelus buqueti

将推定的CbuqPBP1氨基酸序列在TMHMM在线预测网站上预测发现该蛋白没有跨膜区（图2），推测该蛋白为分泌蛋白。用J.Kyte和R.F.Doolittle[23]的方法对CbuqPBP1氨基酸序列进行亲脂性分析，发现CbuqPBP1氨基酸序列中含有较多的亲脂性氨基酸，以第70-80位和第120-140位的亲脂性较强，推测其可能是CbuqPBP1与脂溶性气味物质的结合位点（图3）。

2.2 长足大竹象CbuqPBP1系统发育分析

氨基酸序列相似性分析表明，CbuqPBP1与鞘翅目和鳞翅目17种昆虫的27个PBPs相似性为37.68%。其中，与鞘翅目和鳞翅目昆虫相似性分别为38.47%和52.39%（图4）。应用MEGA 5.0通过邻接法对27个PBPs序列运算1 000次获得系统进化树表明，昆虫PBPs以目聚类的趋势明显，主要分为鳞翅目和鞘翅目两大分支（图5）。目以下分支中，长足大竹象与红铜丽金龟Anomala rufocuprea的ArufPBP2和ArufPBP3在一个亚分支上，说明PBPs聚类结果能较好的反映昆虫间的亲缘关系。

图2 长足大竹象CbuqPBP1跨膜区预测Figure 2 Predicted transmembrane segment of CbuqPBP1 from Cyrtotrachelus buqueti

图3 长足大竹象CbuqPBP1氨基酸亲脂性分析Figure 3 Predicted hydropathy profiles for the amino acid sequences of CbuqPBP1 from Cyrtotrachelus buqueti

2.3 长足大竹象CbuqPBP1表达分析

长足大竹象不同虫态和不同组织中的CbuqPBP1相对表达量见图6。不同虫态体内CbuqPBP1的表达存在差异，雄虫体内的表达量最高，是雌虫表达量的5倍，而幼虫体内的表达量最低，为雄虫表达量的1/100。

在雄虫各组织部位中，CbuqPBP1在触角中的表达量最高，是头部和胸部表达量的41.2倍和114倍，而在腹部和足上几乎不表达。

3 讨论

图4 长足大竹象与其他昆虫的信息素结合蛋白氨基酸序列多重比对Figure 4 Alignment of the amino acid sequences of PBPs from Cyrtotrachelus buqueti and other insects

本文利用RT-PCR和TA技术，首次克隆出长足大竹象一个信息素结合蛋白基因CbuqPBP1。该基因具有昆虫PBPs典型特征，有一个N-末端保守信号肽，具有6个保守的半胱氨酸残基，可用Cys1-X26-Cys2-X3-Cys3-X42-Cys4-X10-Cys5-X8-Cys6表示，符合Xu Y.L.等[24]鉴别鳞翅目昆虫PBPs的经典模式（Cys1-X25-Cys2-X3-Cys3-X36-Cys4-X8-14-Cys5-X8-Cys6）。根据 J.Kyte 和 R.F.Doolittle[23]的方法对氨基酸序列进行亲脂性分析，发现CbuqPBP1有多个较强的亲脂性区域，与已报道的苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus AlinOBP1[25]和桃蛀螟Conogethes punctiferalis CpunPBP1[26]的亲脂性区域相似，推测该区域可能是脂溶性气味分子的结合位点。同源性比较分析表明，CbuqPBP1与红铜丽金龟ArufPBP2和ArufPBP3相似性较高，且聚在同一分支上，推测这3个基因来源同一个祖先基因，由于在长期进化过程中对不同类型环境化学因子刺激的适应和进化使其产生了分化，在不同物种间行使相同或某些类似的功能[27]。

图5 长足大竹象与其他昆虫PBPs氨基酸的系统发育树Figure 5 Phylogenetic tree of PBPs from Cyrtotrachelus buqueti and other insects based on amino acid sequences

图6 长足大竹象不同虫态和雄虫不同组织中CbuqPBP1的相对表达水平Figure 6 Relative expression levels of CbuqPBP1 in bodies at different instars and different tissues male of Cyrtotrachelus buqueti

本研究中，CbuqPBP1在长足大竹象成虫阶段的表达量最高，幼虫期微量表达，说明该基因在成虫求偶过程中起着非常关键的作用。M.Laue和R.A.Steinbrecht[28]与 R.G.Vogt和 L.M.Riddiford[5]研究认为PBPs只在雄虫体内特异性表达，而后来的研究发现如马德拉蜚蠊[29]、斜纹夜蛾[8]、烟草夜蛾Heliothis assulta[30]、绿盲蝽 Apolygus lucorum[31]等昆虫的 PBPs不仅在雄虫体内表达，在雌虫体内也有表达。这可能是雌虫体内的PBPs也能够识别自身的信息素，或者至少能够识别自身信息素复合物的某些成分[32]。本研究发现，CbuqPBP1在雄虫腹部和足上不表达，在触角、头部（去触角）和胸部上均有表达，且在触角上的表达量最高。张升祥[33]发现BmPBP1在家蚕所有组织中均有表达，BmPBP2和BmPBP3在翅和胸足有少量表达，其中，BmPBP3在脂肪体中也有少量表达，而在触角中均有大量表达。张帅等[34]还发现棉铃虫Helicoverpa armigera HarmPBP2在雌虫下颚须内有表达，但仍以触角的表达量最高。说明触角是昆虫感知外界信息和接收性信息素的主要器官。

本研究发现，CbuqPBP1基因在雄虫触角中有较高的表达量，结合该蛋白与长足大竹象信息素类似物的竞争结合实验结果（另文发表），推测CbuqPBP1是一个信息素结合蛋白，在长足大竹象觅偶过程中可能扮演重要角色。而长足大竹象雌性信息素包括多种组分[20]，CbuqPBP1与长足大竹象雌性信息素不同组分的结合关系目前还不清楚，需要做进一步的研究。

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