小儿葛黄止泻颗粒质量标准研究

2018-05-02严常开何建华

中国药业 2018年8期

姚能，严常开，吴宁，郭皓，何建华

（1.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065； 2.武汉药谷科技开发有限公司，湖北武汉 430200）

小儿葛黄止泻颗粒由葛根、黄连、木香等组方，由中医经典名方葛根芩连汤结合临床经验添加白术、木香演变而成，为中药六类新药品种，有解肌清热、止泻止痢功效，适用于小儿因湿热蕴结所致的泄泻、痢疾、泄泻腹痛、便黄而黏、肛门灼热[1]333。方中葛根味甘、辛，性凉，性清轻升发，入脾胃经，既能解表退热，又能升发脾胃清阳之气而治下利，是一物而二任也，故为君药[2]；黄芩和黄连清热泻火、清热燥湿利尿，为臣药[3]；木香行气止痛、健脾消食，炒白术健脾益气、燥湿利水，二者共为佐药；甘草甘缓和中，调和诸药，为使药[4]。合而为方，可升阳止泻、清热燥湿、泻火解毒、行气止痛、健脾消食。为了有效控制产品质量，本研究中建立了鉴别葛根、黄连、黄芩、木香的薄层色谱（TLC）法及测定葛根素含量的高效液相色谱（HPLC）法，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪，含LC－15型色谱泵，SPD－15C型紫外检测器，LC－20AT型色谱泵，SIL－20A型紫外检测器，岛津LC Solution Lite工作站（日本岛津公司）；UV－170型紫外分光光度计（日本岛津公司）；613T超声波清洗机（深圳市洁拓电子科技有限公司，360 W，40 kHz）；204AL型电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）。

1.2 试药

小儿葛黄止泻颗粒（10批，武汉药谷科技开发有限公司，规格为4 g/袋）；葛根素对照品（批号为110752－201514，含量为 95.5%），去氢木香内酯对照品（批号111525－201510，含量为 99.8% ），黄芩素对照品（批号为 111595－200905，含量为 98.5%），黄连对照药材（批号为121551－201404），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甲醇等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

葛根与黄连[5－6]：取小儿葛黄止泻颗粒约 0.4 g，置50 mL锥形瓶中，加甲醇 25 mL，密塞，超声 30 min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；分别取缺葛根、黄连的阴性样品各约0.4 g，同法制成阴性对照品溶液；取黄连对照药材0.4 g，同法制成对照药材溶液；另取葛根素对照品适量，加入甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。分别吸取上述5种溶液各1 μL，点于同一1%NaOH硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（13∶3∶5∶1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下（345 nm）检视。结果供试品溶液色谱展开效果较好，斑点清晰，阴性样品无干扰，结果见图1。

图1 葛根与黄连TLC图

木香[1]105：取小儿葛黄止泻颗粒约 0.4 g，加甲醇10 mL，密塞，超声10 min，滤过，溶液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，得供试品溶液；取缺木香的阴性样品约0.4 g，同法制成阴性对照品溶液；另取去氢木香内酯对照品适量，加入甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液、阴性对照品溶液各5 μL，对照品溶液2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%香草醛硫酸，加热至斑点清晰。结果供试品溶液色谱展开效果较好，斑点清晰，阴性样品无干扰，结果见图2。

图2 木香TLC图

黄芩[1]301：取小儿葛黄止泻颗粒约0.4 g，加甲醇10 mL，密塞，超声10 min，滤过，溶液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，取上清液，作为供试品溶液；取缺黄芩的阴性样品约0.4 g，同法制成阴性对照品溶液；取黄芩素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液、阴性对照品溶液各5 μL，黄芩素对照品溶液2 μL，点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（10∶3∶1∶2）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%FeCl3溶液，加热至斑点清晰。结果供试品溶液色谱展开效果较好，斑点清晰，阴性样品无干扰，结果见图3。

图3 黄芩TLC图

2.2 葛根素含量测定[7]

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Sepax BR－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－水（21 ∶79）；流速：1.0 mL /min；检测波长：250 nm；进样量：5 μL；柱温：35 ℃。理论板数按葛根素峰计算应不低于5 000。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：取葛根素对照品适量，精密称定，用甲醇配制成每1 mL中含葛根素20 μg的溶液，即得。

供试品溶液：取小儿葛黄止泻颗粒约0.52 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇30 mL，密塞，超声提取20 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL置10 mL容量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：取除葛根外的其余药材，按小儿葛黄止泻颗粒处方制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密量取2.2.2项下3种溶液各5 μL，在250 nm波长下进样，记录色谱图。结果阴性对照品溶液在与对照品溶液及供试品溶液色谱相应保留时间处无相应色谱峰，表明阴性对照无干扰，专属性强。结果见图4。

图4 葛根素HPLC色谱图

线性关系考察：分别精密量取葛根素质量浓度为389.64 μg /mL 的对照品溶液（母液），加甲醇稀释(1 mL→100 mL，1 mL→50 mL，1 mL→25 mL，3 mL→50 mL，2 mL→25 mL，3 mL→25 mL)，分别精密吸取上述稀释后溶液各5 μL，分别进样后测定。以对照品溶液质量浓度（μg/mL，X）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝4 772 911.51 X－858.55，r＝0.999 9（n ＝6）。结果表明，葛根素质量浓度在 3.90 ～46.76 μg/mL 范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密量取质量浓度为 15.59 μg/mL的对照品溶液，按拟订条件连续进样6次，计算峰面积。结果的 RSD为0.24%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批(批号为20170601)供试品溶液，分别于 0，3，6，9，12，15，18，21，24 h 时进样，记录峰面积。结果的 RSD为0.48%（n＝9），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20170601）样品干膏粉6份，依法制备供试品溶液。结果葛根素峰面积的RSD为0.56%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知葛根素含量（重复性试验项下）的样品（批号为 20170601）6份，每份约 0.26 g，精密称定，分别精密加入质量浓度为 346 μg/mL的对照品溶液各10 mL，依法制备供试品溶液，按2.2.1项下拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表1。

表1 葛根素加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

按上述供试品溶液制备方法和测定条件，测定10批样品中葛根素含量。结果见表2。

表2 10批样品含量测定结果（mg/g，n＝10）

3 讨论

3.1 定性鉴别

本研究中采用TLC法鉴别葛根、黄连，通过对样品的提取方法、点样量、展开剂种类、溶剂比例等条件进行了筛选，发现在鉴别葛根时，在供试品溶液色谱中发现有与黄连对照药材相同颜色的斑点，通过试验证实，该斑点与黄连对照药材斑点一致，故将黄连与葛根采用相同方法进行鉴别，能有效、快速地鉴别出葛根与黄连。该方法分离度良好，专属性强，可作为葛根、黄连定性鉴别的参考方法。

3.2 定量测定

本研究中采用HPLC法测定小儿葛黄止泻颗粒中葛根素的含量，参考了2015年版《中国药典（一部）》中葛根药材及葛黄芩连丸中含量测定项下的葛根素含量测定方法，结果保留时间较短，样品中主峰与杂质峰无法分开，分离度、理论板数均不理想，最后通过改变流动相比例，确定了甲醇－水（21∶79）为葛根素含量测定的流动相，结果获到了较好的峰型和分离度。