五倍子联合黄芩提取物复合液对牙周膜细胞增殖和周期的影响*

谭学东 ，黎淑芳 ，朱晓莹，黄跃斌，雷 茗

（1.广西壮族自治区百色市右江区人民医院，广西 百色 533000； 2.右江民族医学院，广西 百色 533000）

2015年的流行病调查数据显示，我国 80.0%～97.0%的成年人患有不同程度的牙周病[1]，临床表现为牙龈发炎、出血、疼痛、口臭，严重者会造成牙周组织破坏，导致牙齿与牙龈分离[2]。常规治疗以硝咪唑类（如牙康）、四环素类（如派力奥）及多西环素等药物为主，虽能改善症状，但长期应用疗效欠佳，且复发率较高，故研究牙周疾病的治疗与防治具有较大现实意义[3－4]。祖国医学在牙周病的治疗方面也有较好效果。五倍子又名木附子，具有抗菌、收敛、解毒等功效[5]。黄芩属双子叶植物，有效成分为黄酮类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎及抗氧化等功效[6]。本研究中采用五倍子联合黄芩提取物复合液对牙周膜细胞(PDLC)增殖的影响进行试验观察，为临床应用提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入标准：符合正畸临床诊断标准；均经X线、临床表现等检查确诊。

排除标准：不符合纳入标准；合并有影响效应指标观测及影响判断其他生理或病理情况的疾病。

病例选择：选取医院口腔门诊2015年5月至2016年7月收治的因正畸需要拔除的无龋齿、无牙周病的青少年32例，其中男19例，女13例；年龄 21～27岁，平均（24.2 ± 2.4）岁。

1.2 仪器与试药

低糖DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco Invitrogen Carslbad公司）；胶原酶、碱性磷酸酶试剂盒（美国Sigma St.Louis MO 公司）；四氮唑蓝(MTT，德国 Sigma Deisenhofen公司）；0.25% 胰蛋白酶（美国 Sigma公司）。IMT－2型倒置相差显微镜（日本 OLYMPUS集团）；二氧化碳恒温培养箱（包括SCO5W－2 SHELDONT型培养箱，珠海市造鑫企业有限公司）；考马斯亮蓝试剂盒、鼠抗人波形丝蛋白（由本实验室提供）。五倍子 Rhus chinensis Mill.及黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi.取自右江民族医学院，经右江民族医学院药学院黄锁义教授鉴定为正品。

1.3 方法

1.3.1 PDLC 的培养与分组

取上述患者前磨牙，放入预冷的无菌Hank液中，在超净工作台内，采用无血清DMEM培养液反复冲洗3遍，刮取牙根中部1/3的牙周组织，将其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，取5 mm间隔平铺在50 mL培养瓶底，加入20.0%胎牛血清的DMEM培养基，翻转培养瓶，在37℃及5%CO2环境中连续孵育2 h，再次翻转培养瓶后继续培养，每3 d换液1次，待细胞生长融合80%时，利用2.5 g/L胰酶消化进行传代，倒置显微镜下观察细胞形态，取第5代细胞，备用。根据细胞生长情况，并按加入药物的不同分为黄芩提取液(LPS)组、五倍子组和复合液(LPS＋五倍子)组。

1.3.2 药液制备

取一定量五倍子药材，敲开后除去虫垢及杂质，冲洗清洁，干燥，粉碎，过100目筛，称取50 g，加无离子水100 mL，室温下浸泡24 h，过滤离心，取上清液，共2次；将上清液浓缩并冷冻干燥，所得干粉视为五倍子水提取物纯品。取黄芩50 g，置乙酸乙酯中水浴3 h，将其溶解物过滤和浓缩，残留物溶解于500 mL/L甲醇中；分离出可溶于甲醇的部分进行浓缩，除醇，冷冻干燥，所得干粉视为黄芩提取物纯品。两组纯品等比例混合，加入培养液，最终制备成质量浓度为25 μg/mL的提取物变复合液。

1.3.3 细胞增殖抑制试验

取1.3.1项下生长良好的第5代细胞，调整细胞浓度为3×104/mL，接种在96孔培养板上，24 h培养后去除培养液及未贴壁的细胞。向黄芩提取液（LPS）组细胞液中加入100 μg/mL黄芩提取液，五倍子组细胞液中加入25 μg/mL五倍子提取液，复合液(LPS＋五倍子)组细胞液中加入 25 μg/mL 五倍子提取液、100 μg /mL黄芩提取液及100 μg/mL磷酸盐缓冲液(PBS)，分别进行 3，6，12，24 h 孵育，向每孔中加入 20 μL MTT 溶液培养4 h后于倒置相差显微镜观察细胞形态。在酶联仪490 nm波长下测定吸光度值。1.3.4 细胞总蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝染色法测定细胞总蛋白含量。取第5代细胞，采用0.25%胰蛋白酶调整细胞浓度为1×105/mL 并接种在 96 孔板中，每孔 100 μL，培养 24 h后，吸弃原有培养液，每孔中加入200 μL培养液，分别进行 3，6，12，24 h 孵育，每孔中加入 100 μL 0.1%TritonX溶液，震荡30 min，观察是否为完整的细胞结构后，将其转移至另一块96孔板，加入200 μL考马斯亮蓝染液，振荡10 min，在酶联仪490 nm波长下测定吸光度值。

1.3.5 细胞周期观察

制备五倍子、黄芩提取物，取第5代生长良好的细胞，标准环境下进行24 h培养，LPS组向细胞液中加入100 μg/mL 黄芩提取液，五倍子组中加入 25 μg/mL 五倍子提取液，复合液组中加入25 μg/mL五倍子提取液、100 μg/mL 黄芩提取液及 100 μg/mL PBS 液，连续孵育12 h。采用2.5 g/L胰酶消化细胞，收集在离心管中，离心 5 min，速率为 800～1 000 r/min，加入 4 mL PBS液，去除残渣及细胞碎片，制备单细胞悬液，加入700 mL乙醇固定，用4 mL pH为7.4的PBS溶液吹打后制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×109/mL，加入碘化丙啶液，染色30 min，在酶联仪590～630 nm波长下测定吸光度值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0统计学软件处理。计数资料以百分率表示，行 χ2检验；计量资料，以±s表示，行 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态

倒置相差显微镜下，原代细胞形态多样，以长梭形为主，细胞突起长度不一，核仁清晰，胞体丰富；第4代细胞开始分离纯化，未见上皮样细胞，生长状态良好，胞体丰满；第5代细胞生长速度良好，胞体增大，核仁清晰。详见图1。

2.2 细胞增殖情况、细胞总蛋白含量及细胞周期

结果见表1。

3 讨论

PDLC属牙周组织中的主要功能细胞，具有多向分化潜能，能合成胶原亦可降解胶原，在牙周膜中能不断改进与更新，在创伤修复和组织再生中发挥重要作用[7－8]。中药取材于天然的动植物及矿物，与西药相比具有无污染、不良反应小、易提取等优点。近年来，五倍子联合黄芩提取物复合液在牙周病防治中已得到应用，且效果理想[9]。本研究结果显示，复合液组中 3，6，12，24 h细胞增殖数多于LPS组与五倍子组（P＜0.05）。

五倍子中主要含有五倍子鞣酸，经水解后得没食子酸与葡萄糖，药物具有抗菌作用，能有效抑制或杀灭细菌，且有凝固蛋白的作用，能促进小血管聚集，发挥轻微的止痛功效，且药物中的有效成分能与碱、若干金属等化合物结合，发挥解毒功效[10]。有文献报道，将五倍子提取物运用于牙周病中能有效抑制牙周致病菌，并能抑制PDLC的增殖，从而保护牙周细胞[11－12]。

图1 人体牙周膜细胞形态（×20倍）

表1 3组不同时间点细胞试验结果吸光度值比较（±s）

表1 3组不同时间点细胞试验结果吸光度值比较（±s）

注：与 LPS组比较，aP ＜0.05；与五倍子组比较，bP ＜0.05。

组别 细胞增殖复合液组LPS组五倍子组3 h 0.354 ± 0.009ab 0.312 ± 0.005 0.313 ± 0.006 6 h 0.433 ± 0.010ab 0.326 ± 0.007 0.327 ± 0.007 12 h 0.462 ± 0.010ab 0.336 ± 0.011 0.338 ± 0.012 24 h 0.483 ± 0.013ab 0.363 ± 0.012 0.367 ± 0.013组别 细胞总蛋白含量复合液组LPS组五倍子组3 h 0.492 ± 0.009ab 0.312 ± 0.006 0.314 ± 0.006 6 h 0.518 ± 0.005ab 0.369 ± 0.006 0.370 ± 0.006 12 h 0.633 ± 0.009ab 0.435 ± 0.008 0.433 ± 0.007 24 h 0.672 ± 0.010ab 0.526 ± 0.012 0.529 ± 0.013细胞周期组别复合液组LPS组五倍子组3 h 0.504 ± 0.007ab 0.356 ± 0.004 0.354 ± 0.005 6 h 0.531 ± 0.019ab 0.432 ± 0.015 0.431 ± 0.014 12 h 0.563 ± 0.009ab 0.493 ± 0.016 0.493 ± 0.015 24 h 0.614 ± 0.010ab 0.536 ± 0.013 0.538 ± 0.015

黄芩中的有效成分为黄酮类化合物，具有较强的广谱抗菌作用，能抑制溶血性链球菌、葡萄球菌等生长；同时，还能抗炎、抗变态反应，有效提高细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，还能抑制氧化反应。有文献报道，黄芩能有效抑制牙周可疑致病菌，提高临床效果[13－14]。本研究结果显示，复合液组3，6，12，24 h时的细胞总蛋白含量多于LPS组与五倍子组（P＜0.05），说明五倍子联合黄芩提取物复合液对PDLC具有保护作用，能促进蛋白质的合成；复合液组 3，6，12，24 h时的细胞周期也长于LPS组与五倍子组（P＜0.05），说明五倍子联合黄芩提取物复合液能促进PDLC的增殖，对牙周组织的再生具有明显的促进作用，在促进牙周组织缺损、修复再生方面具有明显优势。

综上所述，五倍子联合黄芩提取物复合液对PDLC具有保护作用，能促进蛋白质的合成，进一步提高细胞增殖及细胞活性。

参考文献：

[1]罗爱华，谢 红，岳朝晖，等.中老年牙周病流行趋势现状及其相关危险因素[J].中国老年学杂志，2016，36（17）：4334－4335.

[2]岳新芝.自我管理教育对慢性牙周病患者治疗依从性和生活质量的影响[J].国际医药卫生导报，2013，19（10）：1506－1508.

[3]Ji K，Liu Y，Lu W，et al.Periodontal tissue engineering with stem cells from the periodontal ligament of human retained deciduous teeth[J].J Periodontal Researc，2013，48（1）：105－116.

[4]栾玉学，李雪梅.中医辨证施治牙周病128例临床疗效观察[J].哈尔滨医科大学学报，2017，51（1）：71－73.

[5]郑 翼，邹 玲，李 伟.五倍子化学组分对脱矿牙釉质再矿化的影响[J].广东牙病防治，2013，21（7）：359－363.

[6]杨 美.黄芩药理作用研究进展[J].医学理论与实践，2012，25（19）：2359－2360.

[7]王 萌，叶 菁，李 晶，等.不同牙周治疗手段对根面结构及牙周膜细胞生长的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2014，24（4）：208－212.

[8]张凤秋，孟焕新，韩吉力，等.釉基质蛋白对人牙周膜细胞生物学影响的体外研究[J].北京大学学报（医学版），2012，44（1）：6－10.

[9]郭姝彤，刘永仙，艾彩莲，等.五倍子有效成分提取分离、药理作用及临床应用研究进展[J].陕西中医，2015，36（6）：762－764.

[10]邓 盟，黎 红，董孝立，等.中药五倍子提取物对牙本质表面性能的强化作用 [J].上海口腔医学，2013，22（2）：164－168.

[11]谭学东，黄跃斌，何印雷，等.中药黄芩有效成分黄芩苷在牙周病防治中的实验研究[J].海南医学，2012，23（15）：26－28.

[12]钱德云，徐自祥.牙周基础治疗联合复方黄芩含漱液控制牙周炎疗效分析[J].现代医药卫生，2012，28（14）：2134－2135.

[13]张 良，唐荣银，倪龙兴.五倍子水提取物对牙龈卟啉菌膜泡抑制牙周膜成纤维细胞生物活性的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2007，17（12）：695－697.

[14]杨保华.五黄提取液对人牙周膜成纤维细胞毒性作用的体外研究[D].济南：山东大学，2012.