miR-532-5p在胃癌中的表达及其对MKN45细胞增殖迁移能力的影响

陈新华，李风萍，陈昭宇，郭伟洪 （南方医科大学南方医院，广东广州510515）

0 引言

胃癌（gastric cancer，GC）的发病率和死亡率均位居全球前列，严重危害人类健康［1-2］，尤其在我国，GC以局部进展期胃癌（advanced gastric cancer，AGC）为主（80%～90%）［3］，肿瘤迁移和侵袭能力强、预后差的特点非常显著［4］。近年来，分子生物学技术的进步给肿瘤的诊断和治疗提供了新思路。因此，分析和探索GC的分子生物学特性，并转化为治疗的新靶点和新方法，仍然具有非常高的临床需求和很突出的时代需求。近年来，越来越多的研究［5-6］提示microRNAs（miRNA）是调节 GC发生发展的重要机制，有望成为潜在的治疗新靶点。

miRNAs是一类单链内源性的非编码微小RNA，能对细胞凋亡、增殖及分化、神经系统发育、免疫调节等众多生命过程起到重要调控作用［7-8］。近期大量研究［9-11］表明，miRNAs的突变或异常表达与人体各种肿瘤的发生发展相关，可以促进肿瘤的进展，也可以发挥抑癌作用。miR-532-5p位于人类染色体的Xp11．23上，具有3'非翻译区的互补序列，可以通过抑制转录下调多种基因产物。miR-532-5p首先被发现在皮肤黑色素瘤中具有促癌作用［12］，但相继也有研究［13-15］发现其在多种实体肿瘤，如卵巢癌、肺癌以及肝癌中表达下调，而细胞功能试验也提示其有抑制肿瘤细胞增殖的作用。Xu等［16］首次报道了 miR-532-5p对人类GC细胞的调节作用和机制，体外试验中过表达miR-532-5p可以显著增加GC细胞集落形成和迁移的潜力，减少G1期细胞的比例，阻滞细胞周期，并且促进细胞凋亡，然而，在临床胃癌组织的检测中并未得到一致的结果。该研究未对此作进一步的延伸探索，但也提示我们，miR-532-5p与胃癌的发生发展可能存在一定关系。因此，结合目前临床上胃癌的诊治亟需开发潜在新靶点的时代需求，进一步深入明确和阐述miR-532-5p在GC发生发展过程的调节作用具有较大的科学意义，甚至可能为GC未来的诊治提供更好的选择。

模板按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，所得cDNA应用 SYBR Green I法进行荧光定量 PCR反应。试验设置3个重复，以U6作为内参，按照说明书推荐的程序进行扩增反应。计算得到的miR-532-5p的相对表达量数值以中位数为截断值，将miR-532-5p的表达水平分为低表达和高表达两组，并分析其表达高低与临床病理参数的关系。

1．2．2 细胞培养和转染 胃癌MKN45细胞株常规培养使用含 10%胎牛血清的 1640培养基，置于37℃、含5%CO2培养箱中培养。当细胞处于对数生长期时接种于6孔板，接种密度控制为4×105个／孔左右，24 h后按照转染试剂说明书利用 Lipofectamine3000转染 miR-532-5p-NC，miR-532-5p-mimics和miR-532-5p-inhibitor，根据不同实验时间要求后收集细胞进行后续实验。实验分为3组，阴性对照组（negative control， NC）、过表达组（mimics）以及干扰组（inhibitor）（表 1）。

表 1 miR-532-5p NC、mimics及 inhibitor序列

1 材料和方法

1．1 主要材料 组织标本：60例新鲜冰冻癌组织和配对癌旁组织标本选取自2016～2017年在南方医科大学附属南方医院普通外科行手术治疗的胃癌患者，所有患者术后均经病理学检查确诊，在术前没有接受放化疗等抗肿瘤治疗。试验所取癌组织为距离病灶边缘1 cm以内组织，癌旁组织为距离癌灶3 cm以外的粘膜组织。所有组织标本的采集均获得患者知情同意，并且由南方医院伦理委员会批准。

试剂：MKN45胃癌细胞购自中科院上海细胞库；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自Takara；引物由上海生工公司设计合成；D1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自HyClone；Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen；Mir-532-5p干扰序列inhibitor及过表达序列mimics由江苏吉玛公司设计合成；CCK8细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天公司；Matrigel基质胶、Transwell培养板购自Corning公司。

1．2 方法

1．2．1 荧光定量 PCR检测miR-532-5p的表达 按照RNAiso（TAKARA，日本）试剂说明书提取癌组织及其配对新鲜冰冻组织总RNA；取500 ng总RNA为

1．2．3 CCK8法检测细胞的增殖能力 转染 24 h后收集细胞，按照每孔 1×103的细胞数接种 96孔板，每组每个时间点均设置5个重复，每孔培养体积为100 μL。 24 h 细胞贴壁后，取0、12、24、48 h 作为时间点分别加入 10 μL CCK-8试剂（DOJINDO，日本），置于37℃环境中孵育2 h，然后在450 nm波长处测定吸光度，并绘制细胞生长曲线。

1．2．4 Transwell法检测细胞的迁移能力 转染 48 h后收集细胞，以200 μL不含胎牛血清的 RIPM 1640培养基重悬细胞，按照每孔 5×104的细胞加入到Transwell上室，下室加入 600 μL含10%胎牛血清的RIPM 1640培养基，孵育24 h后取出上室，去掉上室的培养基，4%多聚甲醛固定细胞15 min，用0．2%结晶紫染色25 min，用棉签擦去上室细胞，用自来水洗上室3次，正置显微镜下随机选择5个视野进行细胞计数并拍照保存。

1．2．5 Transwell法检测细胞的侵袭能力 实验方法基本同迁移实验，唯一区别为所使用是经过Matrigel基质胶包被的上室，制作方法为液态的基质胶原液以不含胎牛血清的 RIPM 1640培养基稀释8倍，取50 μL加入上室中，置于37℃环境，待基质胶凝固30 min后使用。

1．2．6 划痕试验 培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记，细胞消化后种入12孔板，细胞铺满板底后，用10 μL枪头垂直于孔板沿着横线标记均匀用力制造划痕，吸去细胞培养液，用PBS轻轻冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入无血清培养基，拍照记录。将培养板放入培养箱培养，每隔4～6 h取出拍照，直至划痕基本愈合。

1．3 统计学处理 采用SPSS22．0软件进行数据分析。实验数据以±s表示，两组数据比较采用Mann-Whitney U检验。CCK-8实验和流式凋亡实验多组数据比较采用单因素方差分析，组间数据比较采用LSD-t检验。用卡方检验或 Fisher确切概率法及Spearman法进行相关性分析。检验水准为α＝0．05，采用双侧性检验。

2 结果

2．1 GC癌组织和癌旁组织中miR-532-5p表达水平的比较 荧光定量PCR试验分析表明，60例胃癌／癌旁组织中，83．3%呈低水平（图1A），且miR-532-5p的相对表达量低于癌旁组织的相对表达水平（P＝0．0135，图 1B）。

图1 miR-532-5p在GC癌组织中的表达量

2．2 miR-532-5p在GC癌组织中表达量与临床参数之间的关系 miR-532-5p表达量与肿瘤直径（r＝0．314， P＝0．024）、远处转移（r＝ 0．536， P＝ 0．035）具有显著相关性（表2）。

2．3 NC、mimics和 inhibitors组的 MKN45 细胞内miR-532-5p表达水平 MKN45细胞转染后，与NC空白对照组相比，mimics组的miR-532-5p表达显著上调（∗∗P＝0．00015），而转染 inhibitor后，miR-532-5p表达显著下调（∗P＝0．00295），这提示 miR-532-5p低表达和过表达细胞模型构建成功。

表2 miR-532-5p表达与GC患者临床病理参数的关系

图2 NC、mimics和inhibitors组的MKN45细胞内miR-532-5p表达情况（∗p ＜0．005，∗∗p ＜0．001）

2．4 NC、mimics和 inhibitors组 MKN45 细胞增殖能力的比较 CCK8增殖实验显示，相比NC空白对照组，mimics组miR-532-5p表达上调后MKN45细胞生长曲线在4天时间点显著位于NC组下方（∗∗∗p＜0．001），inhibitors组 MKN45 细胞生长曲线在 2 天（∗p＜0．05）、3 天（∗∗∗p＜0．001）、4 天（∗∗∗p＜0．001）时间点均显著位于NC组上方。这表明，说明增强miR-532-5p的表达可以抑制MKN45细胞的增殖，而敲低miR-532-5p的表达可以增强MKN45细胞的增殖。

图3 miR-532-5p NC、mimics和inhibitors转染MKN45细胞后在1、2、3、4天时间点加入CCK8，在490 nm处分析去荧光OD值（∗p ＜0．05， ∗∗∗p ＜0．001）

2．5 NC、mimics和 inhibitors组 MKN45 细胞迁移实验 迁移实验结果显示，相对于NC对照组（实验细胞穿过上室的数量为 185．0±5．8），mimics 组发生迁移的细胞数目（60．0±2．9）显著减少（∗∗∗P ＝0．0005），inhibitors 组发生迁移的细胞数目（292．0+6．9）显著增加（∗P＝0．0318）。 说明过表达 miR-532-5p可以抑制MKN45细胞的迁移能力，反过来敲低miR-532-5p表达可以增强MKN45细胞的迁移能力。

图4 NC、mimics和inhibitors组MKN45细胞迁移能力比较。（∗表示 p ＜0．05， ∗∗∗表示 p ＜0．001， 标尺为 200×）

2．6 NC、mimics和 inhibitors组 MKN45 细胞侵袭能力的比较 细胞侵袭实验结果显示：相对于NC对照组（实验细胞穿过上室的数量为 103．3±5．3），mimics组发生侵袭的细胞数目（20．7±2．2）较 NC 组显著减少（∗∗P＝0．0061），inhibitors组发生迁移的细胞数目（223．0±11．6）较 NC 组显著增加（∗∗P＝ 0．0054）。说明过表达miR-532-5p可以抑制MKN45细胞侵袭能力，干扰miR-532-5p表达可以增强MKN45细胞的侵袭能力。

图5 NC、mimics和inhibitors组MKN45细胞、侵袭能力比较。（∗表示 p ＜0．05， ∗∗∗表示 p ＜0．0001， 标尺为 200×）。

2．7 NC、mimics和inhibitors组的划痕实验结果

相对于NC对照组，mimics组MKN45细胞在24h时内的迁移比例相对降低（∗P＝0．0192），而 inhibitors组MKN45细胞在24 h时的迁移比例相对增强（∗P＝0．0105）。说明过表达miR-532-5p可以抑制MKN45细胞迁移能力，干扰 miR-532-5p表达可以增强MKN45细胞迁移能力。

图6 NC、mimics和inhibitors组MKN45细胞划痕实验（∗p ＜0．05，标尺为 200×）

3 讨论

成熟的miRNA可以通过抑制转录调节多种基因产物，在组织中具有空间和时间的表达特异性，在细胞增殖、凋亡和分化中起重要作用［7-8，17］。 近期大量研究［11，18］表明 miRNA和肿瘤的发生发展相关。 其中，miR-532-5p被研究发现在多种肿瘤中具有调节肿瘤生物特性的功能［12，14，19］。 miR-532-5p 和 GC 发生发展的关系也有相关研究。Xu等［16］的体外实验表明，过表达miR-532-5p可以增强胃癌细胞的增殖能力，其体内实验也证实，过表达miR-532-5p可以增加小鼠体内肺重量及肺移植瘤数量。然而，该研究对新鲜GC癌组织标本进行检测，并未得到相应的实验结果。该研究未对此进一步延伸探索，但也提示我们，miR-532-5p与胃癌的发生发展可能存在一定关系。鉴于miR-532-5p潜在的肿瘤增殖调节功能和胃癌对诊治新靶标的需求，我们对此进行了进一步深入探究，以明确miR-532-5p与胃癌发生发展的关系。我们利用荧光定量PCR实验检测60例GC患者癌组织及其配对癌旁组织中miR-532-5p的表达水平，发现胃癌组织中miR-532-5p的相对表达量低于癌旁组织的相对表达水平。进一步分析miR-532-5p表达与胃癌患者临床病理参数的关系，发现肿瘤体积较大者（直径≥3 cm）和发生远处转移的癌组织中的miR-532-5p表达水平显著下调。因此，我们有理由假设miR-532-5p可以抑制GC的增殖、侵袭和转移，并且进行了后续的细胞功能实验作为验证。后续细胞功能实验进一步证实，miR-532-5p参与抑制GC的增殖、迁移和侵袭。

细胞增殖、迁移、侵袭和转移能力强是恶性肿瘤的主要特征，主要表现为肿瘤细胞的无限增殖能力、细胞周期和侵袭转移的异常调控［20-21］。目前对GC病情判断的诊疗手段有限，主要是体表超声、CT检查、MRI检查、PET-CT检查、超声内镜，往往难以精确判断病情进展［22］。而目前对GC病情的分期主要基于UICC／AJCC制定的TNM分期，现有诊断技术基础上进行TMN分期难以在治疗前对病情做出精确预判［22］，不利于做出最佳治疗方案的选择，只有结合分子生物学诊断，才能做到个体化和精准化治疗［5］。结合临床观察，GC癌组织的miRNA异常表达与胃癌的恶性程度及预后存在密切的联系，在胃癌的动态监测复发、预后甚至治疗等方面具有潜在的应用前景［5］。而本研究提示miR-532-5p能够抑制GC的增殖、侵袭和转移，GC癌组织中 miR-532-5p低表达可作为肿瘤体积较大、发生远处转移的标志，因此，miR-532-5p能够作为胃癌的病情评估、治疗方式选择和判断预后的潜在依据。综上所述，本研究提示miR-532-5p可能通过抑制GC的增殖、迁移、侵袭和转移能力而发挥抑癌作用，潜在可能作为GC抗肿瘤侵袭转移的作用靶点。miR-532-5p在GC演进中的生物相关性是一个值得深入研究的方向，可以为发病率高、预后差的GC的生物学研究提供新的方法和思路。

本研究尚存在一些不足，如组织样本较少，后期可能需要进一步大样本、多中心前瞻性临床研究来验证；其次，miR-532-5p对GC的抑癌机制尚未进一步研究，需要后续进一步实验补充。

【参考文献】

［1］ Hartgrink HH， Jansen EP， van Grieken NC， et al．Gastric cancer［J］．Lancet，2009，374（9688）：477-490．

［2］ Siegel RL， Miller KD， Jemal A．Cancer statistics， 2017［J］．CA Cancer J Clin，2017，67（1）：7-30．

［3］ Hu Y， Huang C， Sun Y， et al．Morbidity and mortality of laparoscopic versus open d2 distal gastrectomy for advanced gastric cancer：A randomized controlled trial［J］．J Clin Oncol，2016，34（12）：1350-1357．

［4］ Chen W， Zheng R， Baade PD， et al．Cancer statistics in China，2015［J］．CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132．

［5］任传利，王立红，韩崇旭，等．循环microRNA在胃癌早期诊断价值的研究进展［J］．转化医学电子杂志，2017，4（5）：37-39．

［6］ Zhao X， Dou W， He L， et al．MicroRNA-7 functions as an anti-metastatic microRNA in gastric cancer by targeting insulin-like growth factor-1 receptor［J］．ONCOGENE，2013，32（11）：1363-1372．

［7］ Ambros V．The functions of animal microRNAs［J］．Nature，2004，431（7006）：350-355．

［8］ Sempere LF， Freemantle S， Pitha-Rowe I， et al．Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronal differentiation［J］．Genome Biol，2004，5（3）：R13．

［9］ Wang W， Luo YP．MicroRNAs in breast cancer： oncogene and tumor suppressors with clinical potential［J］．J Zhejiang Univ Sci B，2015，16（1）：18-31．

［10］ Kohlhapp FJ， Mitra AK， Lengyel E， et al．MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment［J］．Oncogene，2015，34（48）：5857-5868．

［11］ Liz J， Esteller M．LncRNAs and microRNAs with a role in cancer development［J］．Biochim Biophys Acta，2016，1859（1）：169-176．［12］ Kitago M， Martinez SR， Nakamura T， et al．Regulation of RUNX3 tumor suppressor gene expression in cutaneous melanoma［J］．Clin Cancer Res，2009，15（9）：2988-2994．

［13］ Wang F， Chang JT， Kao CJ， et al．High Expression of miR-532-5p，a tumor suppressor，leads to better prognosis in ovarian cancer both in vivo and in vitro［J］．Mol Cancer Ther，2016，15（5）：1123-1131．［14］ Griesing S， Kajino T， Tai MC， et al．Thyroid transcription factor-1-regulated microRNA-532-5p targets KRAS and MKL2 oncogenes and induces apoptosis in lung adenocarcinoma cells［J］．Cancer Sc，2017，108（7）：1394-1404．

［15］ Song X， Wang Z， Jin Y， et al．Loss of miR-532-5p in vitro promotes cell proliferation and metastasis by influencing CXCL2 expression in HCC［J］．Am J Transl Res，2015，7（11）：2254-2261．

［16］ Xu X， Zhang Y， Liu Z， et al．miRNA-532-5p functions as an oncogenic microRNA in human gastric cancer by directly targeting RUNX3［J］．J Cel Mol Med，2016，20（1）：95-103．

［17］ Bartel DP．MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function［J］．Cell，2004，116（2）：281-297．

［18］ Meltzer PS．Cancer genomics： small RNAs with big impacts［J］．Nature，2005，435（7043）：745-746．

［19］ Song X， Wang Z， Jin Y， et al．Original article loss of miR-532-5p in vitro promotes cell proliferation and metastasis by influencing CXCL2 expression in HCC［J］．Am J Transl Res，2015，7（11）：2254-2261．

［20］ Zou M， Baitei EY， Binessa HA， et al．Cyp24a1 attenuation limits progression of BrafV600E-induced papillary thyroid cancer cells and sensitizes them to BRAFV600E inhibitor PLX4720［J］．Cancer Res，2017，77（8）：2161-2172．

［21］ Sun J， Shi R， Zhao S， et al．E2F8， a direct target of miR-144，promotes papillary thyroid cancer progression via regulating cell cycle［J］．J Exp Clin Cancer Res，2017，36（1）：40．

［22］武爱文，季加孚．胃癌分期与临床诊治相关性［J］．中国医学前沿杂志（电子版），2012，4（5）：4-6．