α硫辛酸对阿尔茨海默病模型大鼠海马区CREB、Bcl-2表达的影响

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种年龄相关的中枢神经退行性疾病,常表现为记忆力减退、认知功能障碍及生活能力降低。目前,AD的发病机制仍不明确,对于AD的有效药物治疗依然很少。α硫辛酸是一种独特的氧化-还原双向的氧化应激强效抑制剂,研究表明氧化应激是AD发生发展的重要原因,而cAMP反应元件结合蛋白(p-CREB)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)在抑制凋亡、促进细胞的分化再生、调节细胞的代谢、损伤后的修复等方面有重要的意义。本研究旨在检测α硫辛酸对AD大鼠海马中CREB、Bcl-2蛋白表达的影响,探讨α硫辛酸对于AD可能的保护作用及其机制,为α硫辛酸对于临床治疗AD提供可能的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:健康雄性SD大鼠24只,鼠龄8～12周,体质量250～300 g,由河北工程大学医学院动物实验中心提供。

1.1.2 主要仪器和试剂:Morris水迷宫(北京新天地公司);苏木素伊红(HE)染色试剂盒;红外线扫描仪(Odyssey Li-cor Gene公司);Aβ1-42(美国sigma公司);p-CREB、Bcl-2(Cell signaling Technology公司);α硫辛酸(美国sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:健康雄性SD大鼠于造模前进行水迷宫训练3 d,剔除不符合实验要求的大鼠。随机分为假手术组、模型组、α硫辛酸组,每组各8只。

1.2.2 造模方法:用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射的方式对大鼠进行麻醉,将大鼠固定于脑立体定位仪上,选择Aβ1-42注射靶区为双侧海马CA1区,即前囟向后4.5 mm,矢状缝旁开2 mm。钻开颅骨,暴露硬脑膜,微量进样器缓慢将5 μl聚集态1 μg/μl Aβ1-42注入海马区,注射时间为10 min,并留针10 min,使Aβ1-42充分浸润局部组织。注射完毕缓慢撤针,用骨蜡封堵针孔,缝合切口,局部消毒。假手术组注入等体积生理盐水。

1.2.3 给药方法:α硫辛酸组给予α硫辛酸100 mg/(kg·d)腹腔注射,1次/d。假手术组、模型组腹腔注射等体积的生理盐水,1次/d。共21 d。

1.2.4 Morri水迷宫测试:药物干预完成后运用Morris水迷宫实验方法进行水迷宫测试。(1)定位航行试验:将大鼠随机从水池四个入水点放入水中,入水时使大鼠面向池壁,记录实验大鼠逃避潜伏期时间,即在120 s内寻找到平台的时间。连续测试5 d,2次/d。测试大鼠每天的最终结果为2次4个象限潜伏期的平均值。(2)空间探索试验:测试第6 d撤除平台,将大鼠从入水点面向池壁放入水中,记录其120 s内穿越原来平台位置的次数。其学习记忆能力根据大鼠潜伏期的长短和穿越原平台次数表示。

1.2.5 大鼠海马组织结构的观察:大鼠断头取出脑组织,置于4%多聚甲醛内4 ℃冰箱固定48 h。将脑组织标本常规各梯度乙醇脱水,二甲苯透明,融化的石蜡内充分浸蜡包埋,行切片厚度为5 μm的连续切片。将切片脱蜡至水洗,用苏木精水溶液染5 min,自来水浸泡15 min,伊红染色5 min,脱水透明,封片,用光学显微镜观察海马组织结构并拍照记录。

1.2.6 Western Blot测定大鼠海马p-CREB、Bcl-2的表达:大鼠断头取脑分离出海马组织,置液氮中保存。取海马组织加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制剂混合物,用超声匀浆器破碎组织后离心,取上清作为待分析的样品。用BCA法测定蛋白浓度。取样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜,TBST封闭,分别与p-CREB、Bcl-2、抗GAPDH抗体进行杂交,4 ℃孵育过夜,洗膜3次,加二抗室温孵育1 h,TBST洗二抗4次。洗膜后应用红外激光成像系统检测p-CREB、Bcl-2的蛋白表达,以GAPDH为内参照。

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试学习记忆能力

2.1.1 定位航行实验结果:各组大鼠5 d内水迷宫中逃避潜伏期随时间延长均有下降,随着训练的次数的增多,假手术组大鼠逃避潜伏期明显下降,而AD模型组大鼠逃避潜伏期下降不明显,2组比较,差异有统计学意义(P<0.01);α硫辛酸组与AD模型组比较,大鼠的逃避潜伏期明显缩短,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠在水迷宫中逃避潜伏期的比较

注：与假手术组比较,**P<0.01;与AD模型组比较,△△P<0.01

2.1.2 空间探索实验结果:AD模型组跨越平台次数为(5.88±1.83)次,与假手术组的(14.75±2.99)次比较,差异有统计学意义(P<0.01);α硫辛酸组跨越平台次数为(9.54±3.09)次,与AD模型组比较,α硫辛酸组穿越平台的次数明显增加(P<0.01)。

2.2 大鼠海马CAl区HE染色 假手术组锥体细胞数量稍有减少,其形态、排列及分布无明显差异;AD模型组海马CAl区锥体细胞较正常对照组细胞数量明显减少,细胞肿胀,核结构模糊,结构轮廓模糊,大小形态不规则,排列稀疏;α硫辛酸组与AD模型组大鼠相比,大鼠海马数量和形态均不同程度恢复,锥体细胞数量增多,无明显肿胀,结构完整,细胞排列整齐、致密。见图1。

图1 各组海马CAl区HE染色

2.2 Western Blot测定大鼠海马p-CREB、Bcl-2的蛋白表达水平 与假手术组比较,AD模型组中大脑海马组织中p-CREB、Bcl-2蛋白水平表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与AD模型组相比,α硫辛酸组大鼠海马p-CREB、Bcl-2蛋白水平表达明显增多,差异有统计学意义(P<0.01),见表2、图2、图3。

表2 各组p-CREB和Bcl-2表达水平比较(n=8)

注:与假手术组比较,**P<0.01;与AD模型组比较,△△P<0.01

图2 各组标本p-CREB蛋白表达情况

图3 各组标本Bcl-2蛋白表达情况

3 讨论

AD典型的病理学特征是老年斑、神经元纤维缠结和神经元减少。而老年斑的核心为Aβ,Aβ在脑内沉积是AD早期的主要病理变化,凝聚状态的Aβ和Tau蛋白共同作用于细胞及细胞器,二者相互作用放大对神经元的毒性作用[1]。本研究向大鼠的海马双侧注射Aβ1-42,使大鼠的神经元发生变性、坏死,促进凋亡基因的表达,从而形成学习与记忆能力减退的AD动物模型。Morris水迷宫结果显示,AD模型组大鼠的平均逃避潜伏期较假手术组显著延长,跨越平台的次数也明显减少,而给予α硫辛酸干预后,α硫辛酸组在空间辨别、学习记忆方面明显改善。从病理形态学上表现,HE染色可见AD模型组海马CAl区神经元细胞减少,核结构模糊,锥体细胞层排列紊乱,而α硫辛酸干预组神经元的损害较AD模型组减轻。

p-CREB称为“转录增强因子”,主要表现为能够刺激基因转录,是多种蛋白激酶的磷酸化底物。研究发现,长时性记忆需要新蛋白质的合成[2],活化了的p-CREB是学习记忆的分子标志,可调节转录的活性,促进学习记忆基因被大量转录,并进一步促进与学习记忆相关的新蛋白质的合成,促进长时性记忆的形成[3]。Bcl-2是被认为具有抗凋亡作用的重要基因之一,而细胞凋亡是AD引起神经元丧失的主要原因。有研究发现，在AD病人脑退化的神经细胞中,Bcl-2基因的含量明显减少[4]。同时有研究证实,Aβ1-42可以下调抗凋亡基因Bcl-2的表达[5]。本实验研究的结果显示,双侧海马一次性注射Aβ1-42诱导AD大鼠模型后,模型组大鼠海马p-CREB及Bcl-2的蛋白表达水平较假手术组明显降低,说明了模型组大鼠海马CREB-Bcl-2信号转导通路的活动受抑制,从而损害了AD模型大鼠的记忆学习能力。

氧自由基能够氧化修饰多种生物活性分子,使细胞原有的功能和结构完全丧失,生物酶失活,最终引起细胞凋亡[6]。研究显示Aβ可诱导神经细胞生产氧自由基,在对抗氧化应激过程中,脑组织会代偿性地加速Aβ生成,同时氧化应激还可诱导Tau蛋白的磷酸化[7],二者共同作用,加大神经毒性作用。α硫辛酸是目前已知效果最强的一种天然抗氧化剂。研究发现,α硫辛酸能够在体外抑制Aβ蛋白聚集,减少Aβ的形成,同时还能够使已经聚集的Aβ降解[8]。Farr等[9]的研究表明,给予α硫辛酸干预的转基因AD模型大鼠较未干预的大鼠在学习和记忆能力方面明显增强。

综上所述,α硫辛酸能够保护Aβ对海马神经细胞的损害,提高AD模型大鼠的学习记忆能力,其可能的作用机制是通过抑制氧化应激损伤,提高大脑海马组织中CREB-Bcl-2信号通路的活化水平,从而减少神经细胞凋亡,促进学习及记忆功能。本研究结果为α硫辛酸应用于AD的治疗提供了一定的理论依据,但由于本实验仅为动物实验,样本数量相对较少,对于α硫辛酸应用于临床还需要更多的研究给予支持。

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