广东省云浮地区女性和儿童地中海贫血基因分型情况分析

江炎章

地中海贫血是我国南方地区较为常见的遗传性溶血性疾病，与遗传相关的珠蛋白基因突变、基因缺失等是引起此病的主要危险因素，此病患者一般会有珠蛋白链合成异常[1]。根据血红蛋白合成障碍的珠蛋白类型，地中海贫血常见的类型主要是α-地中海贫血和β-地中海贫血。由于严重类型(包括重型和中间型) α或β地中海贫血均为致死性或致残性血液病，目前尚无理想的治愈方法，故在目前，通过大规模人群的遗传筛查、遗传咨询和产前诊断，避免受累胎儿的出生是最佳选择[2],也是目前控制地中海贫血发生最为有效的措施[3-4]。为了解云浮地区女性和儿童人群地中海贫血基因分型的情况，并探讨地中海贫血基因检测在婚检、产检中的重要性，笔者选取2016年10月—2017年9月在我院进行地中海贫血基因检查，并确诊为地中海贫血的女性和儿童的地中海贫血基因分型情况进行分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2016 年 10 月— 2017 年 9 月来我院体检，经地中海贫血基因确诊为地中海贫血的女性和儿童。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

使用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)。

1.2.2 仪器

分子杂交仪:亚能YN-H16，China;PCR仪：BIO-RAD C1000,USA。

1.3 标本采集

抽静脉血2 mL，用枸橼酸钠或 EDTA抗凝。

1.4 检测方法

1.4.1 样本DNA提取

①1.5 mL离心管中加入500 μL细胞裂解液LB；②加入100 μL抗凝全血样品，剧烈涡旋10～20 s；③加入100 ul沉淀液PB，剧烈涡旋10～20 s；④12 000 r/min离心5 min；⑤小心转移上清液至套进2 mL收集管的DNA结合柱的凹缝下方，12 000 r/min离心30 s；⑥小心取下收集管，弃滤液。结合柱重新套进2 mL收集管，加500 μL洗涤液W1至DNA结合柱的凹缝下方，12 000 r/min离心30 s；⑦小心取下收集管，弃滤液。结合柱重新套进2 mL收集管，加500 μL洗涤液W2至DNA结合柱的凹缝下方，12 000 r/min离心30 s；⑧重复上一步骤一次；⑨小心取下收集管，弃滤液。结合柱重新套进2 mL收集管， 12 000 r/min离心2 min；⑩小心取出结合柱，套进1.5 mL干净离心管中，加100 μL洗脱液EB(10 mM Tris-HCL,pH 8.5)至膜中心，室温放置1 min，12 000 r/min离心1 min；小心取出结合柱，1.5 mL离心管底部即是DNA溶液。

1.4.2 模板加样

①从冰箱中取出PCR反应液Ⅰ、Ⅱ和阴、阳性对照各一份，平衡至室温。②PCR反应液Ⅰ、Ⅱ低速离心数秒，在反应管上标上与标本DNA相对应的编号。③吸取2 μL标本DNA加入相应编号的PCR反应液Ⅰ、Ⅱ中。吸取2 μL阳性质控加入标有阳性对照的PCR反应液Ⅰ、Ⅱ中，吸取2 μL阴性质控加入标有阴性对照的PCR反应液Ⅰ、Ⅱ中，盖紧管盖。④PCR反应液Ⅰ、Ⅱ低速离心数秒。

1.4.3 PCR扩增

根据PCR仪标准操作规范，按照以下条件进行扩增(升温速率3.0 ℃/s，降温速率3.0 ℃/s，程序扩增完后12 ℃保存)。

50 ℃ 15 min

96 ℃ 15 min

97 ℃ 45 s

62 ℃ 50 s

72 ℃ 75 s

97 ℃ 45 s

59 ℃ 50 s

72 ℃ 75 s

72 ℃ 5 min

1.4.4 杂交显色

①将PCR反应液Ⅰ、Ⅱ传送至产物分析区，打开杂交仪，预热至43 ℃，同时打开电磁炉，开始煮水。检查A、B液是否为透明液体。如室温低，杂交液出现结晶，请温浴后使用。②拿出膜条袋，记录膜条袋上批号，取出膜条，在膜条编号区写上与PCR反应液Ⅰ、Ⅱ相对应的编号。③把带标记的膜条底面对折，缩短长度后按顺序分别放入15 mL杂交管中，手持试管架轻微震荡，使膜条沉到底部，然后加入6 mL A液，确保A液液面没过膜条。④把对应编号的PCR扩增产物依次全部加入到15 mL杂交管中，加入时应把枪头伸至A液液面之下，且枪头尽量远离膜条。为降低产物污染可能性，加PCR产物后应避免反复吹吸。⑤把杂交管管盖拧紧，将离心管放入沸水浴中煮沸10 min，且确保A液液面完全位于沸水液面之下。⑥沸水浴后，带上棉手套,取出杂交管，拧紧管盖，最好每四个或六个一扎，首尾相接，用橡皮筋扎实，放入43 ℃杂交仪中，注意对称平衡。杂交时间不少于1.5 h，最长不超过4 h。⑦取50 mL离心管，倒入50 mL B液，拧紧管盖后放入43 ℃杂交仪中预热至43 ℃。⑧杂交完成后，先取出15 mL杂交管拧开，然后再取出少量(1～2个)50 mL离心管，用镊子把杂交管中的膜条快速转入装有预热好B液的50 mL离心管中，拧紧管盖后轻轻晃动管子把重叠的膜条拉开，将50 mL离心管置于杂交仪中，等全部放进去后，洗涤15 min。注意，先将15 mL杂交管拧开，再将50 mL离心管拿出，此过程应快速完成，防止B液温度下降。⑨配制孵育液(需新鲜配置)。配方：A液∶POD=2000∶1。膜条张数≤10时，20 mL A液加10 μL POD配成20 mL孵育液；膜条张数>10时，按1张膜条1 μL POD的比例配制孵育液。⑩洗膜完毕后，用镊子夹取膜条至已配制好的孵育液中，室温轻摇孵育至少30 min，孵育时应注意使膜条字面朝下并尽量散开，避免完全重叠影响效果。孵育完毕，弃去孵育液。用A液室温轻摇洗涤两次，每次5 min。接着用C液室温洗涤1～2 min，同时配制显色液洗完后，弃去A液，倒入C液浸没膜条，室温轻摇洗涤1～2 min，同时配制显色液，按顺序加入19 mL C液、1 mL TMB、2 μL 30% H2O2，配成一份显色液，混匀，避光。C液洗涤完后，夹取膜条浸泡于显色液中，避光显色5～15 min，5 min时观察显色情况，如已显色可判断结果，即可终止，最好不要超过15 min，显色时应注意使膜条字面朝下并尽量散开，避免完全重叠影响效果。显色完成后，夹取膜条至纯净水中终止显色。

1.4.5 结果判定

2 结果

选取2016年10月—2017年9月期间在我院进行地中海贫血基因检查，并确诊为地中海贫血的女性144例和儿童98例进行基因型分析。

144例地中海贫血女性：其中α-地中海贫血基因 89 例，占阳性率的61.8%，缺失类型主要以αα/-SEA(-SEA 缺失杂合子)为主，β-地中海贫血基因突变 55 例，占阳性率的 38.2%，主要以 CD41-42 位点的单突变杂合子为主，具体见表1。

98例地中海贫血儿童： 其中α-地中海贫血 70 例,占阳性率的71.4%，主要以αα/-SEA(-SEA缺失杂合子)基因型为主。β-地中海贫血基因突变 28 例，占阳性率的 28.6%，主要以654M/N基因型为主，具体见表2。

表1 144例女性地中海贫血患者基因型分型情况

表2 98例儿童地中海贫血患者基因型分型情况

3 讨论

地中海贫血在我国南方是一种常见的遗传性疾病，以两广地区高发，其中广东地中海贫血基因携带率为11.07%[5]，广西地中海贫血基因携带率为25.30%[6]。云浮处于两广交界，是地中海贫血的高发地区，地中海贫血防控不可轻视。临床上根据其基因型将α地中海贫血分为静止型、标准型、中间型和重型。静止型或标准型α地中海贫血是4个α基因仅缺失1个，表现为静止型；如果缺失2个则为标准型。中间型α地中海贫血即血红蛋白H病，是4个α基因缺失3个。重型α地中海贫血即血红蛋白Bart胎儿水肿综合症，是由于父母双方均为α地中海贫血，胎儿4个α基因全部缺失，也是α地中海贫血中最严重的类型，胎儿多在妊娠30～40周于宫内死亡或产后数小时死亡。β地中海贫血的发生主要是该基因的点突变，少数由于基因缺失引起。基因的点突变或某些基因缺失可致β肽链的生成完全受抑制，称为β0地中海贫血；有些点突变使β肽链的生成部分受抑制，则称为β+地中海贫血。同源染色体上的 2 个等位基因突变类型相同者称为纯合子；2 个等位基因中只有一个突变点称为杂合子；2 个等位基因突变类型不同者称为双重杂合子。临床上可分为轻型、中间型和重型，轻型β地中海贫血是β0或β+地中海贫血的杂合子状态；中间型β地中海贫血是一些β+地中海贫血的双重杂合子和某些地中海贫血的变异型的纯合子，或两种不同变异型珠蛋白生成障碍性贫血的双重杂合子状态；重型β地中海贫血是β0或β+地中海贫血的纯合子或β0与β+地中海贫血双重杂合子[7]。

本研究结果显示，云浮地区女性和儿童地中海贫血主要以α-地中海贫血为主，其中以αα/-SEA(-SEA 缺失杂合子)基因型为主，与国内其他地区的α-地中海贫血基因型类似[8-10]。本地区女性β-地中海贫血以41-42M/N基因型为主，其次为 654M/N基因型；儿童β-地中海贫血以654M/N基因型为主， 其次为41-42M/N基因型。由此可见本地区女性与儿童携带的主要地中海贫血基因型是基本相同的，地中海贫血防控任务还很重，做好地中海贫血知识的宣传和教育，提高人们对地中海贫血的认识，加强婚、孕检人群的地中海贫血基因检测是减少和防止重型地中海贫血患儿出生的有效措施。特别是夫妇双方如果一方已经确诊是地中海贫血患者，另一方一定也要做地中海贫血基因检查，排除地中海贫血；如果夫妻双方携带的地中海贫血基因型相同，也要做好遗传咨询和产前诊断，这样可以更好地避免或减少重型地中海贫血儿的出生，从而减轻社会和家庭的负担，实现优生优育。

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