大黄素对大鼠急性脊髓损伤后继发脊髓水肿的影响

曾欢欢，黄英如，李子健，汪 一，张 松

1.重庆医科大学中医药学院针灸骨伤教研室，重庆市400016；2.中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆市400016

急性脊髓损伤是脊柱外伤与脊柱手术的严重并发症，至今还没有有效的治疗措施[1]。原发性脊髓损伤后数小时至数天内，会出现复杂的继发性损伤，包括损伤局部脊髓水肿、缺血缺氧、炎症反应、细胞凋亡、脂质过氧化等[2]。由于受到软脊膜和硬脊膜等的限制，原发性脊髓损伤后继发的脊髓水肿，将使得脊髓内压增高，导致脊髓内微循环障碍，进一步加重脊髓缺血缺氧和细胞死亡等病理变化。减轻/抑制脊髓损伤后的继发性脊髓水肿程度，保护原发性脊髓损伤后残存的神经细胞，对急性脊髓损伤后患者肢体功能恢复非常重要。

大黄素是从中药大黄的干燥根中提取的主要活性单体成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[3-4]。大黄素能调节肺组织水通道蛋白(aquaporin,AQP)-1和AQP-5的表达，减轻急性重症胰腺炎诱导的肺水肿和盲肠穿孔性败血症诱导的肺水肿[5-6]。本实验观察大黄素对急性脊髓损伤后继发性脊髓水肿的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠180只，体质量180～200 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SYXK(渝)2012-0001。在实验过程中对大鼠的处理均按照国家颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》和重庆医科大学医学研究伦理委员会的要求严格执行。按照随机数字表法将大鼠分为假手术组(A组)、模型组(B组)、大黄素低剂量组(20 mg/kg，C组)、大黄素中剂量组(40 mg/kg，D组)和大黄素高剂量组(80 mg/kg，E组)[3,7]，每组36只。

1.2 主要试剂、仪器

大黄素，纯度≥98%，产品批号A0044：成都曼思特生物技术有限公司。AQP-4、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)抗体：美国ABCAM公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体：美国NOVUS公司。Trizol试剂，RR047A逆转录试剂盒，AQP-4、MMP-2、GAPDH引物：日本TAKARA公司合成。苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin staining,HE)试剂盒：中国索莱宝公司。伊文思蓝(Evans blue,EB)染料：美国SIGMA公司。CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统、T100TMPCR仪：美国BIO-RAD公司。凝胶成像系统：美国ODYSSEY-FC公司。BX51正置显微镜：日本OLYMPUS公司。低温高速离心机：德国SIGMA公司。

1.3 动物模型及给药

2%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定，以T10棘突为中心作2 cm切口，剥离筋膜，切开椎板，暴露T10胸髓，采用Allen法以重10 g打击棒从2.5 cm高度自由落下撞击于T10胸髓[8]，逐层缝合伤口。打击后损伤处脊髓出现出血肿胀，致伤瞬间尾部会痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动后，出现双下肢瘫痪即为造模成功[9]。

A组仅行手术暴露。

术后10 min内，C、D、E组分别腹腔注射大黄素溶液20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，A组、B组腹腔注射等体积生理盐水。每天1次，共28 d。手术过程严格无菌操作，每只大鼠术毕予以20万U青霉素钠腹腔注射预防感染，持续3 d；术后每天定时给予3次人工膀胱排尿，直至大鼠能够自主排尿。

1.4 检测指标

1.4.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分

术后3 d、7 d、14 d及28 d[10]，每组随机取6只大鼠进行BBB评分[11-12]。评分由熟悉本实验评分标准的非本组实验人员独立进行，观察5 min。每只大鼠测3次，取平均值。在评分前被抽取大鼠应检查其膀胱是否充盈，以免因膀胱充盈而影响评分结果。

1.4.2 斜板实验

在术后3 d、7 d、14 d及28 d，每组随机取6只大鼠，将大鼠的身体纵轴放于与木板横轴垂直的木板上，从水平位置(0°)起逐渐增大木板角度，每次升高5°，以大鼠能够在木板上停留5 s而不下滑的最大角度作为其神经功能值。实验评分由熟悉本实验评分标准的非本组实验人员独立进行。

1.4.3 HE染色

术后3 d，每组随机取3只大鼠，2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于操作台上，剑突下剪开腹腔，暴露心脏，将灌注针刺入主动脉内，剪开右心耳，用微量泵灌注生理盐水，直到右心耳流出无色液体后，灌注4%多聚甲醛至四肢僵硬。2 h后，以脊髓损伤点为中心，取出头侧、尾侧约0.5 cm脊髓组织，放入4%多聚甲醛浸泡保存。常规石蜡包埋、连续切片，片厚5 μm。进行HE染色，在400倍光学显微镜下观察。

1.4.4 脊髓含水量测定

术后3 d，每组随机取6只大鼠，2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后固定，剥离椎旁肌肉，快速取出脊髓组织，以脊髓损伤点为中心，头侧、尾侧各留取0.5 cm。取出的脊髓标本立刻称其湿重，置于80℃烤箱内干燥48 h至恒重，称其干重；重复测量3次后取均值，计算脊髓组织含水量。

1.4.5 血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier,BSCB)通透性检测

使用EB作为示踪剂，检测BSCB通透性变化[13]。术后3 d，各组随机取6只大鼠，处死前2 h从股静脉注入2%EB溶液20 mg/kg，观察大鼠眼睛、足趾变蓝后，提示染料分布均匀。以断头法处死大鼠，取以损伤点为中心的头侧、尾侧2 cm脊髓，放于甲酰胺3 ml中，54℃水浴24 h后取上清，酶标仪在波长632 nm处测量吸光度值，绘制EB标准曲线，根据标准曲线计算EB含量(μg/g)。

1.4.6 AQP-4、MMP-2 mRNA表达

采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测 AQP-4、MMP-2 mRNA表达。术后3 d，每组随机取3只大鼠，取以损伤点为中心的头侧、尾侧0.5 cm脊髓组织，Trizol裂解后提取总RNA。检测RNA浓度及纯度后，按RR047A试剂盒操作步骤配制反应体系，放于T100TMPCR仪中进行逆转录，根据SYBR Green法配制Mix及反应体系后上机进行反应。运用CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统读取Ct值。以2-ΔΔCt表示其余四组与假手术组目的基因表达的倍比关系。

重复3次试验，计算平均值。

上下游引物序列分别见表1。

表1 上下游引物序列

1.4.7 AQP-4、MMP-2蛋白表达

采用Western blotting检测AQP-4、MMP-2蛋白表达。术后3 d，每组随机取6只大鼠，2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后固定并快速取出以损伤点为中心头侧、尾侧脊髓组织0.5 cm，按1 ml/100 mg比例加入裂解液置于冰上裂解15 min，匀浆后4℃静置1 h，4℃低温12000 r/min离心，共15 min，取上清按照BCA蛋白浓度测定试剂盒检测浓度，上样量45 μg，采用Bradford法测定蛋白含量，浓度调定后等体积上样，10%分离胶，5%浓缩胶，电泳70 V 30 min后100 V 80 min，恒定电流200 mA 180 min转膜，5%脱脂奶粉封闭90 min，一抗孵育过夜(AQP-4 1∶1000，MMP-2 1∶2000，GAPDH 1∶5000)，二抗孵育 1 h，化学发光仪显影，用Image J软件分析各条带相应值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计分析。数据以(xˉ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BBB评分

术后3 d、7 d、14 d及28 d，B组BBB评分较A组降低(P＜0.05)。术后7 d、14 d、28 d，C组、D组和E组BBB评分均高于B组(P＜0.05)，且E组BBB评分均高于C组和D组(P＜0.05)。术后14 d和28 d，D组BBB评分均高于C组(P＜0.05)。见表2。

2.2 斜板实验

术后3 d、7 d、14 d及28 d，B组斜板实验角度较A组降低(P＜0.05)。术后7 d、14 d及28 d，C组、D组和E组斜板实验角度高于B组(P＜0.05)，且E组斜板实验角度均高于C组和D组(P＜0.05)。术后14 d和28 d，D组斜板实验角度均高于C组。见表3。

2.3 HE染色

术后3 d，A组偶见少量炎性细胞核，脊髓组织各形态结构完整，各层细胞排列整齐，无肿胀和出血；B组损伤节段内有大片出血灶，神经细胞肿胀、破坏，大量炎性细胞浸润，组织间隙增宽，水肿严重；而C、D、E组上述病理改变均有所改善，其中E组改善最明显，神经细胞破坏最轻。见图1。

2.4 脊髓组织含水量

术后3 d，B组脊髓组织含水量较A组增高(P＜0.05)。D、E组脊髓组织含水量低于B组和C组(P＜0.05)，B组和C组间脊髓组织含水量比较无显著性差异(P＞0.05)，E组低于D组(P＜0.05)。见表4。

2.5 BSCB通透性

术后3 d，B组EB含量高于A组(P＜0.05)，C组、D组和E组EB含量均低于B组(P＜0.05)，D组和E组低于C组，E组低于D组(P＜0.05)。见表5。

2.6 AQP-4、MMP-2 mRNA表达

术后3 d，B组AQP-4、MMP-2 mRNA表达较A组升高(P＜0.05)，C组、D组和E组AQP-4、MMP-2 mRNA 表达均低于 B 组(P＜0.05)，E 组 AQP-4、MMP-2 mRNA表达低于C组和D组(P＜0.05)；D组AQP-4 mRNA表达低于C组(P＜0.05)。见表6。

2.7 AQP-4、MMP-2蛋白表达

术后3 d，B组AQP-4、MMP-2蛋白表达高于A组(P＜0.05)，C组、D组和E组AQP-4、MMP-2蛋白表达均低于B组(P＜0.05)，D组和E组均低于C组(P＜0.05)，E组低于D组(P＜0.05)。见表7、图2。

表2 各组脊髓损伤后各时间点BBB评分

表3 各组脊髓损伤后各时间点斜板实验结果(°)

图1 大鼠脊髓损伤后3 d脊髓组织(HE染色，400×，bar=50 μm)

表4 各组脊髓损伤后3 d脊髓组织含水量(%)

表6 各组脊髓损伤后3 dAQP-4、MMP-2 mRNA表达

表5 各组脊髓损伤后3 d脊髓组织EB含量(μg/g)

表7 各组脊髓损伤后3 dAQP-4、MMP-2蛋白表达(灰度值比值）

图2 各组脊髓损伤后3 d脊髓组织AQP-4、MMP-2蛋白表达

3 讨论

原发性脊髓损伤后出现继发性脊髓病理变化，将使原发性脊髓损伤后残存的神经细胞继续受到损害，这是脊髓损伤后肢体功能恢复困难的重要原因。减轻/抑制脊髓损伤后的继发性脊髓损伤，保护原发性损伤后残存的神经细胞，对脊髓损伤后肢体功能恢复具有重要意义。脊髓损伤后局部内环境平衡被打破，BSCB遭到破坏，在一系列的血管通透性相关因子、细胞毒性因子以及炎症因子的介导下，出现局部水肿和炎症反应[14]，而急性脊髓损伤后脊髓水肿和炎症将加重神经元缺血、缺氧，甚至引起神经元死亡。研究证实[15-16]，急性脊髓损伤后抗水肿、抗炎治疗，能保护原发性损伤后残存的神经细胞，有利于脊髓损伤后肢体功能恢复。大黄素具有抗炎、抗水肿和改善微循环等药理作用[3-4]。本实验针对大黄素治疗脊髓损伤进行相关研究。

脊髓损伤的实验动物模型较多，其中脊髓打击伤的动物模型能较好地复制临床脊髓损伤病理变化[17]，本实验选择Allen法制作脊髓打击伤模型。通过查阅文献确认，大黄素选择20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg作为治疗剂量[3,7]，给药方式是腹膜内注射给药，这是由于术后10 min给药时，实验大鼠仍然处于麻醉状态，不便口服给药。主要选择在脊髓损伤后水肿的高峰期，术后3 d检测脊髓水肿主要指标[18-19]。

BBB评分和斜板实验是目前常用的神经功能评定法。BBB评分[20]包括后肢功能恢复过程中几乎所有的行为学变化，斜板实验[21]简单易操作，皆用于评价大鼠脊髓损伤程度和其后肢的运动功能恢复情况。本实验BBB评分及斜板实验结果显示，大黄素高浓度组效果较好。HE结果显示，脊髓损伤后，神经细胞肿胀、破坏，大量炎性细胞浸润，组织间隙增宽，水肿严重，经大黄素治疗后，上述病理变化显著减轻，与BBB评分及斜板实验评分基本吻合。

AQP-4在脑和脊髓中广泛分布，是在脊髓星形胶质细胞膜上高表达的水通道蛋白，控制中枢神经系统水分的进入和排出，具有双向水通道调节的作用[22]。研究发现[23]，脊髓损伤后AQP-4大量表达可导致急性脊髓水肿，而抑制AQP-4蛋白表达可减轻细胞水中毒和脊髓水肿指数。本实验结果显示，大黄素中、高浓度组脊髓组织含水量与模型组比较降低。AQP-4 mRNA和蛋白表达结果显示，各治疗组较模型组表达降低，且具有剂量依赖关系。这也与BBB评分、HE染色以及脊髓组织含水量趋势基本吻合，推测大黄素通过抑制急性脊髓损伤后AQP-4表达，减轻继发性脊髓水肿程度，促进大鼠运动功能恢复。

MMP-2是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成员，MMPs是一组锌依赖肽链内切酶家族，能降解几乎所有的细胞外基质蛋白，改变细胞外微环境，促进细胞迁徙[24-25]。研究显示[26]，MMP-2参与人类继发性脊髓损伤过程，MMP-2高表达可导致蛋白质破裂，中性白细胞、巨噬细胞浸润，微血管通透性和BSCB通透性增加，血管源性脊髓水肿形成而进一步加重脊髓损伤。本实验结果显示，脊髓损伤后3 d，MMP-2 mRNA和蛋白表达增高，大黄素治疗后降低。

EB在生理情况下不能透过BSCB，在BSCB被破坏后才可渗漏到脊髓组织中。本实验通过EB染色检测BSCB通透性，结果显示，大鼠脊髓损伤后EB含量增加，大黄素治疗后EB含量降低。因此我们认为，急性脊髓损伤后应用大黄素治疗能下调MMP-2 mRNA和蛋白表达，降低BSCB通透性，减轻脊髓水肿程度，达到对损伤脊髓的保护作用，这也与HE染色以及AQP-4的表达基本吻合。

综上所述，大鼠急性脊髓损伤后应用大黄素治疗，通过下调AQP-4和MMP-2表达，减轻炎症反应，保护BSCB，减轻急性脊髓损伤后水肿程度，这有利于保护脊髓损伤后残存神经元，促进后期肢体功能康复。除能减轻急性脊髓损伤后的继发性脊髓水肿外，大黄素对脊髓损伤后脊髓具体保护机制，还需继续研究。

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