miR-449c在胃癌中的表达

吴志明，黄洪军，孟兴成，储修峰，王焕根，邱海江

胃癌是常见的消化系统恶性疾病，是我国导致癌症相关死亡的重要原因[1-2]。胃癌的发生受饮食、环境、遗传、感染等多因素影响，发病机制很复杂[3]。目前手术仍然是治疗早期胃癌最有效的方式，但只有30%～40%的患者在胃癌早期得到确诊，大多数患者往往诊断时错失了手术治疗的机会。此外，胃癌具有较高的复发率和较低的5年生存率[4-5]。文献表明，胃癌组织存在许多miRNAs表达异常，在胃癌发生、发展中扮演着重要角色，与细胞生长、凋亡、迁移、侵袭密切相关。为发掘敏感有效的miRNAs标记物，笔者选取2009年本院32例患者，通过检测胃癌组织中miR-449c的表达情况，探讨其与胃癌发生及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组共32例，男21例，女11例。年龄40～67岁，平均（54.78±10.66）岁。其中管状腺癌12例，黏液腺癌5例，乳头状腺癌5例，印戒细胞癌4例，低分化腺癌4例，其他特殊类型胃癌2例。根据美国NCCN的 TNM分期标准，I期2例，Ⅱ期3例，Ⅲ期20例，Ⅳ期7例。纳入标准：符合胃癌诊断标准，且经病理学或细胞学确诊；均未经放化疗治疗；均同意将其相关组织应用于研究，签订知情同意书。均进行随访，了解术后生存情况。记录的生存时间自经病理确诊至末次随访或死亡时间，随访时间截至2012年6月。32例均获得随访，随访时间4～30个月，中位随访时间16个月。

1.2 胃癌细胞株 本研究中使用的胃癌细胞株SNU-1，SNU-5，SNU-16和AGS均购自美国培养物保藏所（ATCC），并于含15%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，培养条件为37℃ 、5%CO2培养箱中静置培养。

1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测癌旁组织（normal gastric tissue, NGT）、胃癌组织（gastric cancer, GC）miR-449c表达 取NGT和GC组织各1 mg，提取样品中的总RNA。再取500 ng总RNA通过逆转录酶和cDNA Omniscript reverse transcription kit试剂盒（Qiagen公司）合成cDNA。以两种组织样本cDNA作为模板，分别加入miR-449c基因引物（Qiagen公司），置于Rotor-Gene 6000 定量PCR仪（Qiagen公司）上进行基因扩增检测。采用2－△△ct法检测胃癌组织和癌旁组织miR-449c表达情况。

1.4 RT-PCR检测各细胞株中miR-449c表达 复苏AGS、SNU-1、SNU-5、SNU-16细胞，将其培养在100 g/L 的胎牛血清的RPMI1640 细胞培养基。在各组细胞培养至贴壁 80% 以上，用含 5% EDTA的胰酶消化离心收集细胞。按照上述方法提取各组细胞中总RNA，采用qRT-PCR法检测各细胞中miR-449c表达水平。

1.5 细胞转染 将培养的SNU-16细胞和AGS细胞接种于6孔细胞版中，待细胞贴壁生长至80%，采用Lipofectamine 2000转染法通过miR-449c抑制物和无质粒对照对AGS细胞进行转染。转染24～48 h，通过qRT-PCR法做后续miR-449c表达检测。

1.6 MTT检测 将转染前后的SNU-16细胞、AGS细胞稀释后加到96孔培养板中，分别于12、24、36、48、72 h加入MTT 溶液，37℃ 下孵育 4 h，弃上清，加入DMSO混匀10 min，检测吸光度以检测其细胞生长活力。

1.7 流式细胞术检测转染前后的SNU-16细胞、AGS细胞凋亡情况 将转染48 h的SNU-16细胞、AGS细胞置于106个细胞/mL的PBS中，复染后通过流式细胞术检测SNU-16细胞、AGS细胞凋亡情况。

1.8 观察指标 观察NGT、GC组织及不同细胞株中miR-449c表达水平，并进行比较；观察转染后SNU-16细胞、AGS细胞miR-449c表达水平；观察转染前后SNU-16细胞、AGS细胞细胞的生长活力变化；观察转染后SNU-16细胞、AGS细胞凋亡情况；随访30 个月，对miR-449c低表达和高表达患者的进行Kaplan-Meier生存分析。

1.9 统计学方法 用SPSS 17.0统计学软件进行分析，等级计数资料采用秩和检验，计量资料用（±s），两组间比较采用t检验，三组及以上比较采用方差分析，miR-449c低表达和高表达患者生存率比较采用Kaplan-Meier生存分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGT、GC组织及不同细胞株中miR-449c表达水平 GC组织miR-449c表达明显低于NGT组织（P＜0.05）， 且 AGS、SNU-1、SNU-5、SNU-16细胞miR-449c表达均明显低于NGT组织（P＜0.05），在检测细胞株中，AGS细胞miR-449c表达最高，SNU-16细胞miR-449c表达最低。见图1。

图1 NGT、GC组织及不同细胞株中miR-449c表达水平

2.2 转染后SNU-16细胞miR-449c表达、生长活力及凋亡情况 采用miR-449c模拟物对miR-449c表达最低的SNU-16细胞进行转染，其miR-449c表达水平明显高于空质粒转染（scr）（P＜0.05），二者细胞生长活力均成上升趋势。但采用miR-449c模拟物转染的SNU-16细胞生长活力明显低于scr（P＜0.05），凋亡率明显高于scr转染（P＜0.05）。见图 2。

2.3 转染后AGS细胞miR-449c表达、生长活力及凋亡情况 采用miR-449c抑制物对miR-449c表达最高的AGS细胞进行转染，其miR-449c表达水平明显低于scr转染（P＜0.05），二者细胞生长活力均成上升趋势。但采用miR-449c抑制物转染的AGS细胞生长活力明显高于scr（P＜0.05），凋亡率明显低于scr转染（P＜0.05）。见图3。

图2 转染后SNU-16细胞miR-449c表达、生长及凋亡情况

图3 转染后AGS细胞miR-449c表达、生长及凋亡情况

2.4 miR-449c低表达和高表达患者Kaplan-Meier生存分析 32例中，miR-449c低表达16例，miR-449c高表达16例。随访30个月，miR-449c高表达患者生存率明显高于miR-449c低表达者（P＜0.05）。且miR-449c低表达的患者在随访20个月时全部死亡，miR-449c高表达的患者在在随访30个月时仍有50%的生存率。见图4。

图4 Kaplan-Meier生存分析

3 讨论

胃癌的发生受饮食、环境、遗传、感染等多因素影响，发病机制很复杂，在致病因子的长期作用下，由胃黏膜慢性炎症—萎缩性胃炎—肠上皮化生—不典型增生逐步发展而来[6]。萎缩性胃炎、肠上皮化生以及不典型增生，作为胃癌的癌前病变，其中肠化生常伴有萎缩性胃炎是癌前病变长期发展的重要阶段[7]。胃癌不仅仅是多个基因和蛋白质编码的变异，同时还存在许多miRNAs表达异常，miRNAs是长约22个核苷酸的内源性非编码RNA，通过转录后调控靶基因表达，在胃癌发生、发展中扮演着重要角色，与细胞生长、凋亡、迁移、侵袭密切相关[8-9]。研究发现，miRNAs通过碱基配对调控基因表达[10]，对癌症发展等许多生物事件均有调控作用[11-12]。在miRNAs中，miR-449c对癌症的抑制作用在肺癌[13]和肝癌[14]中的报道较多，但在鲜少有对胃癌抑制的相关报道。本研究通过检测胃癌组织中miR-449c的表达情况，探讨其与胃癌发生及预后的关系，为临床治疗提供依据。

本研究检测NGT、GC组织及不同细胞株中miR-449c表达水平，结果显示，胃癌组织miR-449c表达明显低于癌旁组织（P＜0.05），且AGS、SNU-1、SNU-5、SNU-16细胞miR-449c表达均明显低于癌旁组织（P＜0.05）。在检测细胞株中，AGS细胞miR-449c表达最高，SNU-16细胞miR-449c表达最低。表明胃癌组织中miR-449c的低表达可能与胃癌的发生具有一定的相关性，同时因为在检测的铬细胞株中SNU-16细胞miR-449c表达最低，AGS细胞miR-449c表达最高，故对SNU-16细胞进行miR-449c模拟物转染，对AGS细胞进行miR-449c抑制物转染。

本研究中，SNU-16细胞转染后结果显示，其miR-449c表达水平明显高于空质粒转染（scr）（P＜0.05），二者细胞生长活力均成上升趋势。但采用miR-449c模拟物转染的SNU-16细胞生长活力明显低于scr（P＜0.05），凋亡率明显高于scr转染（P＜0.05）。表明miR-449c模拟物转染后增强了SNU-16细胞的miR-449c表达，从而降低了癌细胞生长活力，增加了癌细胞凋亡率。AGS细胞转染后结果显示，其miR-449c表达水平明显低于空质粒转染（scr）（P＜0.05），二者细胞生长活力均成上升趋势。但采用miR-449c抑制物转染的AGS细胞生长活力明显高于scr（P＜0.05），凋亡率明显低于scr转染（P＜0.05）。表明miR-449c抑制物转染后降低了AGS细胞的miR-449c表达，从而增强了癌细胞生长活力，减少了癌细胞凋亡率。

本研究根据32例患者miR-449c表达情况，将其分为miR-449c低表达和高表达，随访30个月。经Kaplan-Meier生存分析结果显示，miR-449c高表达患者生存率明显高于miR-449c低表达者（P＜0.05），且miR-449c低表达的患者在随访20个月时全部死亡，miR-449c高表达的患者在在随访30个月时仍有50%的生存率。表明miR-449c表达水平可能与胃癌患者的预后密切相关，miR-449c表达高水平有助于提高患者生存率。

miR-449c在胃癌组织中低表达，可明显抑制细胞生长，促进细胞凋亡，其低表达可能与胃癌患者低生存率有关。因为本研究样本量有限，后续应扩大样本量做进一步研究。另外我们推测，胃癌患者的血浆／血清miR-449c的表达明显低于健康人，结合血浆miR-449c表达具有组织特异性，而对血浆内特定miR-449c表达进行监测可能将成为未来癌症高危人群早期筛查的手段。本课题组亦希望继续通过对miR-449c的深入研究，为胃癌的防治积累相关的基础研究资料，以期提高早期胃癌的确诊率及中晚期胃癌患者的生存率。

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