脑灵汤及其萃取物对脆性X综合征的作用及机制的研究

周海燕 欧文斌 陈盛强 黄月玲 叶炳飞 戴丽军 孙卫文

【摘要】 目的：研究脑灵汤及其萃取物对脆性X综合征的作用。方法：选择Fmr1基因敲除小鼠50只，其中空白组、溶媒组、挥发油组（A组）、皂甙组（B组）、水溶物质组（C）组各10例，空白组使用健康的Fmr1基因敲除小鼠，其他四组选用抑制GSK-3建模，A、B、C组分别使用脑灵汤萃取的挥发油、皂甙和水溶物进行颈后肌肉注射治疗。比较五组小鼠的行为学结果。结果：水迷宫、AGS test及曠场实验中观察组3组小鼠表现虽然比对空白组有一定的差距，但较溶媒组出现了较明显的改善。结论：脑灵汤及其萃取物对小鼠抑制GSK-3模型的脑功能恢复有一定的疗效。

【关键词】 脑灵汤； 萃取物； 脆性X综合征

【Abstract】 Objective：To study the effect of brain spirit soup and its extracts on fragile X syndrome.Method：50 mice were given Fmr1 gene knockout，they were divided into the control group，solvent group，volatile oil group （A group），ginsenoside group （group B），water soluble substance group （C） group，10 cases in each group.The control group was given Fmr1 gene knockout mice and the other four groups with inhibition of GSK-3 modeling.A，B，C group were respectively given Nao Ling Decoction extraction of volatile oil，soap glucoside and water soluble intramuscular injection treatment of neck.The behavioral outcomes of the five groups were compared.Result：In water maze test，AGS test and open field test，the performance of the 3 groups in the observation group had a certain difference compared with blank group， but they were better than those of the solvent group.Conclusion：Nao Ling Decoction and its extract on inhibition of GSK-3 model in mice brain function recovery has certain curative effect.

【Key words】 Nao Ling Decoction； Extract； Fragile X syndrome

First-authors address：Shaoguan Occupational Disease Prevention and Treatment Hospital，Shaoguan 512026，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.04.009

脑灵汤是由杜仲、补骨脂、红景天、白参、何首乌、淫羊藿、菖蒲等药组成的临床经验方[1-2]，具有补肾活血、化痰开窍之功效，可延缓痴呆的病情发展、明显改善患者的生活质量。遗传性智力低下是神经系统疾病中的一类主要疾病，脆性X综合征（fragile X syndrome）是最常见的遗传性智力低下性疾病之一，其发病率男性约为1/1 250，女性为1/2 500，占非特异性智力低下的2%～6%，在X连锁智力低下中占40%。

1 材料与方法

1.1 实验动物 观察组选取Fmr1基因敲除小鼠30只，年龄40日，体重20～24 g，雌雄鼠各半采用随机分组法将以上小鼠分为三组，每组10只，A组使用脑灵汤挥发油建模，B组使用脑灵汤皂甙建模，C组使用脑灵汤水溶性成分建模。参照组共20只普通健康Fmrl基因敲除小鼠，年龄40日，体重20～24 g，雌雄鼠各半，由广州医科大学实验动物中心提供。将其分为2组，每组各10只，分别为空白组和溶媒组。空白组使用健康的Fmr1基因敲除小鼠，其他四组选用抑制GSK-3建模。Fmr1基因敲除方案为构建慢病毒载体介导的ser-133siRNA并在脑立体定位下注射，以下调GSK-3表达。

1.2 药物 脑灵汤选用由杜仲、补骨脂、红景天、白参、何首乌、淫羊藿、菖蒲等药组成的临床经验方，萃取前每100 mL含生片1.6 g[3-4]。采用超临界CO2萃取法获得脑灵汤不同萃取物即挥发油、皂甙、水溶性成分等。制剂萃取前每100 mL含生片成分1.6 g，萃取后挥发油氯仿溶液每100 mL含有效成分350 mg，皂甙酒精溶液每100 mL含有效成分310 mg，浓缩水溶液每100 mL含有效成分220 mg。最终制剂按2 mg/针，挥发油（A组）含量为3 mg，皂甙（B组）含量为3.5 mg，水溶物质（C组）含量为3 mg。实际给药量为每40 g体重给药量0.5 mg（折合60 kg体重给药量750 mg）[5]。观察组给药方式为颈后肌肉注射[6]。

1.3 方法 （1）morris水迷宫：使用直径1.5 m的小鼠morris水迷宫站台，规格：直径8 cm，高度20～35 cm，观察小鼠找到站台的时间和游泳路径[7-8]。（2）open field旷场：使用35×35×30 cm小鼠旷场测试器进行测试，网高12 cm，实验时间为120 s，观察小鼠穿过网的次数、站立的次数[9-12]。（3）AGS test听源性惊厥实验：0.5 m内使用36、45、60 dB信号进行听源性惊厥实验，观察小鼠惊厥反应的次数。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫结果 从游泳路径上看，空白组小鼠的游泳路径具有很强的目的性，选择较为典型的一例，其几乎直线游到岸边，三次选择不同地点试图登上侧壁未果后，选择接近直线的距离穿过迷宫，中途接近站台，接近90°转向登陆平台。而溶媒组小鼠的游泳路径明显缺少目的性，几乎总是在原地转圈。观察组三组小鼠的游泳路径同样缺少目的性，特别是A组和B组，虽然其转圈半径比溶媒组略大，且其多次靠近岸边试图寻找出路，但其游泳路径缺少目的性。C组小鼠游泳过程有了一定的目的性，其与空白组更为接近，但其绕行站台接近一圈后才爬上站台。观察组3组小鼠上岸时间虽然比对空白组有一定的差距，但比溶媒组出现了较明显的改善，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 open field旷场实验结果比较 观察组旷场测试效果明显优于溶媒组，但距离空白组有一定的差距。观察组中效果最好的为C组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 AGS test听源性惊厥实验结果比较 听源性惊厥实验中，空白组小鼠并未发生明显的惊厥反应，在45 dB和60 dB时各出现2例次，溶媒组的惊厥反应较为频繁。而观察组3组小鼠的惊厥表现，介于空白组和溶媒组之间，较溶媒组有了较为显著的改善。见表3。

3 讨论

脑灵汤是由杜仲、补骨脂、红景天、白参、何首乌、淫羊藿、菖蒲等药组成的临床经验方，该方是中西医结合背景下的新中医验方。《中药大词典》中记载，杜仲配伍补骨脂，可以温补肾阳、兼补脾肝、既涩下元、又固冲任[13]，这与传统中医认为精神疾病来自肾虚肝郁相符。而红景天补肺阴，《现代实用本草》认为红景天有中枢抑制作用。白参补气，对脾胃虚弱、肺气不足有一定的疗效[14]。何首乌可以温肝补肾，《本草纲目》认为此物气温味苦涩，苦补肾，温补肝，能收敛精气。淫羊藿补命门、益精气、强筋骨、补肾壮阳[15]。菖蒲，《本草汇言》有记载，石菖蒲，利气通窍，如因痰火二邪为眚，致气不顺、窍不通者，服之宜然[16]。综上，脑灵汤实际是以宣肺法驱痰湿，内补外调，安神定风，是针对脑病的一剂良方。

本研究使用超临界CO2萃取法获得脑灵汤不同萃取物，并通过GC-MS分析得到脑灵汤不同萃取物的化学组分，利用Fmr1基因敲除小鼠动物模型探讨使用脑灵汤及其萃取物后AGS test，Open field test，morris水迷宫等行为是否恢复至野生鼠水平，观察其治疗作用，找出最有效剂量[17]，同时在离体和在体水平运用免疫组织化学、组织化学、氨基酸分析、细胞培养、电生理等方法探讨脑灵汤及其萃取物对Fmr1基因敲除小鼠治疗的可能机制[18-20]。

本文使用双盲法对脑灵汤的萃取物在Fmrl基因敲除小鼠抑制GSK-3模型上进行试验，发现脑灵汤萃取物虽然不能完全缓解脆性X综合征的模型，但其相比较溶媒组获得了较好的治疗效果，这将为脆性X综合征的治疗提供一种新的思路，为研发新的治疗脆性X综合征的药物提供实验依据，并为今后的临床运用提供理论基础和实验方法。

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（收稿日期：2017-09-12） （本文编辑：周亚杰）