樟叶越桔叶内生真菌的抑菌活性研究

樊苗苗 陈肖学 张 訸 罗旭璐 曾为林 刘 丽 伍建榕 李 靖 赵 平

(1. 西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；2. 西南林业大学生物多样性保护与利用学院，云南 昆明 650224；3. 西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224)

植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物组织内，但不引起植物组织明显病害症状的真菌，是植物微生态系统中的天然组成部分，在促进宿主生长、抗逆和抗病害等方面扮演着重要角色[1]。自1993年Stierle等[2]首次从短叶红豆杉 (Taxusbreviflora) 韧皮部分离得到具有生产抗癌物质紫杉醇的安德氏紫杉菌 (Taxomycesandreanae) 以来，引起了研究者对内生真菌的广泛关注。随后研究人员发现许多内生真菌能够生产与宿主植物相同或相似的活性次生代谢产物，其成为获取活性天然产物的重要来源之一[3-5]。张文豪等[6]从侧柏 (Platycladusorientalis) 1株内生真菌球毛壳菌 (Chaetomiumglobosum) 发酵液中分离得到的球毛壳菌素A对枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis) 等4种病原细菌具有较强的抑菌活性。王丽薇等[7]从无花果 (Ficuscarica) 叶中分离得到的1株炭角菌属 (Xylaria) 内生真菌，其代谢产物细胞松弛素Q对11种植物病原真菌和3种肿瘤细胞均具有较强的抑制活性。

樟叶越桔 (Vacciniumdunalianum) 为杜鹃花科 (Ericaceae) 越桔属植物[8]，多年生常绿灌木，生于山坡灌丛、阔叶林下或石灰山灌丛，主产于云南、四川、贵州、西藏等地，在云南主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东南[9-10]。其幼嫩叶芽氨基酸种类齐全，含量丰富，据记载自明代开始即作为茶代用品在滇中地区长期饮用至今，具有祛风除湿、舒筋活络等功效[11-12]。Zhao等[13]研究发现该植物富含咖啡酰熊果苷类功能性物质，但其高含量蓄积是否与植物内生真菌协助宿主植物抵御胁迫有关尚不清楚。迄今为止，国内外对越桔属植物内生真菌的研究较少，且多集中内生真菌的多样性研究方面[14-16]。仅徐大可等[17]从笃斯越橘 (V.uligionsum) 根部获得1株具有病原真菌拮抗活性的内生细菌DUT菌株，该菌株对菜豆炭疽病病原真菌 (Colletotrichumlindemuthianum)、越桔叶斑病病原真菌 (Pestalotiopsissp.) 和柯氏帚梗柱孢霉 (Cylindrocladiumcolhounii) 的抑菌率分别为70.5%、68.6%和57.7%。

本研究以小麦雪腐病菌 (Typhlaincarnata) 等10种植物病原真菌作为靶标菌，首次采用平板对峙法和生长速率法评价樟叶越桔叶内生真菌的拮抗效果及其代谢产物的抑菌活性，以期为具有抑菌活性内生真菌的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验菌株

2016年10月采集云南省武定县樟叶越桔健康植物叶片组织，分离得到的34株内生真菌作为本研究供试内生真菌，经形态鉴别和分子鉴定后保存，菌株编号及其归属见表1。

表1 34株樟叶越桔叶内生真菌菌株归属Table 1 Strain attribution of 34 endophytic fungi from the leaves of V.dunalianum

以10种常见植物病害病原真菌 (小麦雪腐病菌、三七丝核病菌 (Verticilliumcinnabarium)、棉花枯萎病菌 (Fusariumoxysporiumf. sp.vasinfectum)、辣椒炭疽病菌 (Colletotrichumcapsici)、番茄灰霉病菌 (Botrytiscinerea)、辣椒镰刀病菌 (Fusariumsolani)、梨黑星病菌 (Venturiapyrina)、水稻稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea)、黄瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporiumsp.cucumebrium)、白菜黑斑病菌 (Alternariabrassicae)) 作为本研究供试病原真菌。

1.1.2培养基

PDA培养基用于培养内生真菌，PDB培养基用于内生真菌发酵。

1.2 实验方法

1.2.1菌株培养

内生真菌平板培养 在超净工作台中将灭过菌的PDA培养基倒平板，每个平板约倒20 mL培养基，用接种针挑取菌丝体部分接种于平板中央，置于28 ℃培养箱中恒温培养7 d。

内生真菌发酵培养 各菌株在PDA培养基上活化培养5～7 d后，用直径0.5 cm的打孔器在菌落边缘制备菌饼，分部接入50 mL PDB液体培养基中，在28 ℃、180 r/min 的恒温摇床中培养5～7 d，得到种子液。配制新的PDB液体培养基，每瓶接入约3%的种子液，在28 ℃、180 r/min的恒温摇床中培养7 d，结束发酵。

1.2.2发酵液的处理

采用抽滤装置对各菌株发酵液进行抽滤，发酵滤液在1 200 r/min、4 ℃条件下离心10 min，上清液转入灭菌离心管中重复离心2次，所得上清液用0.22 mL微孔滤膜过滤后，于4 ℃条件下保存备用。

1.2.3抑菌活性测试

发酵液的抑菌实验 采用生长速率法[18-19]测定发酵液对10种植物病原真菌的抑菌活性，按公式 (1) 计算抑菌率：

抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径 × 100%

(1)

内生真菌与病原真菌拮抗实验 采用对峙法[20]测定内生真菌对病原真菌的拮抗活性。根据内生真菌抑菌活性结果，从中选取抑菌活性强弱不等的25个菌株进一步测定它们对植物病原真菌的拮抗效果，并选用抑菌响应指数较高的小麦雪腐病菌、三七丝核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和白菜黑斑病菌等5种病原真菌作为拮抗指示菌株，按公式 (1) 计算抑菌率。

抑菌率 < 25%标记为 “+”，25% ≤ 抑菌率 < 50%标记为 “++”，抑菌率 ≥ 50%标记为 “+++”,“-” 表示没有抑制作用，抑菌指数为 “+” 个数的累加数值[21]。

2 结果与分析

2.1 内生真菌发酵液对病原真菌的抑制作用

不同内生真菌发酵液对不同病原真菌的抑菌活性差别较大，见表2。抑菌活性最强的菌株是VDL36，抑菌指数为17，且对三七丝核病菌、番茄灰霉病菌和辣椒镰刀病菌等3株病原真菌的抑制率超过50%，其中对番茄灰霉病菌的抑菌活性最强 (图1)，抑菌率达85.17%。其次，抑菌活性较强的菌株是VDL31和VDL166，抑菌指数为16，它们至少对4种以上的病原真菌表现出较高的抑菌活性。但VDL105和VDL106对10株病原真菌均无抑菌活性。此外，就同一植物病原菌而言，不同内生真菌发酵液对其抑制效果也不同。其中，对白菜黑斑病菌表现出抑菌活性的内生真菌菌株最多，有28株，抑菌响应指数达48；其次对三七丝核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和小麦雪腐病菌分别有27、27、27和23株菌株表现出抑菌活性，抑菌响应指数分别为41、36、34和30。

2.2 内生真菌对病原真菌的拮抗作用

前人研究表明，抑制率 ≥ 75%为强拮抗能力，抑菌率为50%～75%具有较强拮抗能力，抑制率 < 50%为弱拮抗能力[21]。樟叶越桔叶内生真菌对白菜黑斑病菌 (图2) 和三七丝核病菌 (图3)拮抗作用较强，抑菌率最高分别达到66.47%和68.57%，见表3。抑菌率 > 75%的菌株有VDL36，抑菌率为50%～75%的菌株有9株，抑菌率 < 50%的菌株有15株。VDL105和VDL106对5种植物病原真菌均无拮抗作用，与表2所示结果一致。从对单一病原真菌的抑菌率来看，对小麦雪腐病菌抑菌率 > 50%的有VDL31和VDLS67，三七丝核病菌抑菌率 > 50%的有VDL36、VDL570、VDL164和VDL42，番茄灰霉病菌抑菌率 > 50%的有VDL36，辣椒镰刀病菌抑菌率 > 50%的有VDL36，白菜黑斑病菌抑菌率 > 50%的有VDL570、VDLS64、VDLS84、VDL166和VDLS62。VDL36对5种植物病原真菌均表现出较强的拮抗活性，其中对番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和三七丝核病菌拮抗作用较强，抑菌率分别为83.26%、68.82%和68.57%，与生长速率法所得出的结果相吻合。

表2 内生真菌发酵液对10种植物病原真菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effects of the fermentation broth of endophytic fungi on 10 plant pathogenic fungi

图1烟曲霉菌VDL36发酵液对番茄灰霉病菌的抑制效果
Fig.1 Inhibitory effects ofA.fumigatusVDL36 onBotrytiscinerea

图2菌株VDL164和VDL166对白菜黑斑病菌的拮抗效果
Fig.2 Antagonistic effects of VDL164 and VDL166 strains onA.brassicae

图3菌株VDL164和VDL166对三七丝核病菌的拮抗效果
Fig.3 Antagonistic effects of VDL164 and VDL166 strains onV.cinnabarium

表3 内生真菌对5种植物病原真菌的拮抗效果Table 3 Antagonistic effects of endophytic fungi on 5 plant pathogenic fungi

3 结论与讨论

本实验结果表明，樟叶越桔叶内生真菌对白菜黑斑病菌和三七丝核病菌的抑菌活性最强，这2种植物病原真菌更适合作为樟叶越桔叶内生真菌抗菌活性指示菌株。且樟叶越桔叶内生真菌次生代谢产物对这2种植物病原真菌的抑菌响应指数最高，有望以高活性菌株发酵产物为基础，开发出防治白菜黑斑病和三七丝核病的相关微生物制剂。

拮抗活性实验表明有10株内生真菌分别对小麦雪腐病菌、三七丝核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和白菜黑斑病菌具有较强的拮抗效果。其中，VDL36对5种植物病原真菌均表现出拮抗活性，尤其对番茄灰霉病菌、辣椒镰刀病菌和三七丝核病菌的拮抗活性较强，抑菌率分别为83.26%、68.82%和68.57%。樟叶越桔叶内生真菌VDL36对多种植物病原真菌的高拮抗活性结果与其他来源烟曲霉具有的抑菌活性类似，如源于北极海泥的烟曲霉对白色念珠菌 (Candidaalbicans) 具有较好的抑制活性[22]，源于恒山黄芪的烟曲霉对番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、辣椒疫霉病菌 (Phytophthoracapsici)、烟草赤星病菌 (Alternariaalternata) 等均表现出较强的拮抗活性[23]，表明针对烟曲霉抑菌活性物质值得进一步深入系统的开展研究，具有良好的开发利用前景。此外，曲霉属真菌能产生多种次生代谢产物，不仅具有新颖独特的结构，而且具有抑菌、抗癌、抗肿瘤、杀虫和除草等多种生物活性[24-25]，是活性先导化合物的主要来源之一。如Sugie等[26]从委瑞内拉土壤中来源的赭曲霉 (Aspergillusochraceus) CL41582菌株的发酵液中分离得到的化合物CJ-17665，具有良好的抑制金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)、酿脓链球菌 (Streptococcuspyogenes) 生长的活性，Song等[27]从中国渤海海底60 m沉积物中分离得到的杂色曲霉 (Aspergillusversicolor) MF030 的固体发酵提取液中分离得到的化合物brevianamides S具有选择性抗结核分枝杆菌的活性，表明曲霉属内生真菌抑菌活性较强，值得进一步深入研究和开发利用。

目前对植物内生真菌的研究显示，约有30%的内生真菌能够产生抗菌活性物质，对多种病原真菌具有广谱性或专一抗性[28]。本研究中除了菌株VDL105和VDL106之外，供试34株内生真菌中有32株均表现出不同程度的抑菌活性。此外，内生菌代谢产物的活性因菌株不同而有较大差异，即使同一菌株对不同病原真菌的抑制活性也不同。樟叶越桔叶中的内生真菌也不例外，如VDLS67和VDL31对小麦雪腐病菌的抑制活性分别为61.00%和58.05%，而其他23个菌株对小麦雪腐病菌的抑制活性均小于50%，个别菌株甚至不表现出抑菌活性。VDLS64只对白菜黑斑病菌表现出强的抑菌活性，而对其他4种植物病原真菌的抑菌活性都较弱，同样说明植物内生真菌对不同病原真菌的抑菌作用既表现出一定的选择性，也具有专一性。

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