鸡传染性支气管炎病毒LN 株基因组序列测定与致病性分析

阿依古丽·艾班， 程晋龙， 刘晓宇， 张国中

(1.中国农业大学动物医学院， 北京 海淀 100193；2. 新疆维吾尔自治区呼图壁县动物疾病预防控制中心， 新疆 昌吉 831200)

鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，是目前危害我国养禽业的主要疫病之一。 IBV不仅侵害鸡的呼吸系统，还会对泌尿生殖系统造成损伤。 病鸡主要表现为呼吸困难、喷嚏、气管啰音，蛋鸡蛋品质和产蛋量下降，病鸡可能会由于严重的肾脏病变或呼吸道症状死亡。 雏鸡阶段感染IBV，还会对母鸡生殖系统造成永久性损伤，对后期产蛋量造成严重影响，直接制约养禽业的发展。 1991 年开始，IB 开始在我国大范围传播，其中对我国影响较大的是1997 年分离得到的QX 型IBV[1]。 QX 型IBV 主要引起泌尿生殖系统和呼吸系统的损伤。 有研究表明，近年来，与H120 等疫苗相关基因型分离率有所下降，而QX 型IBV 的检出率逐渐升高[2，3]，说明IBV 在我国的流行依然严重。 系统分析IBV各毒株的遗传演化规律和致病性，对养禽生产中提高对IB 的防控能力具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 毒株的繁殖复壮 CK/CH/LN14/01/2014(简称LN 株)：由本实验室从辽宁省某发病鸡群中分离获得。 鸡群已免疫过Mass 型相关疫苗。 将病毒在10 日龄SPF 鸡胚中进行传代，至出现稳定胚变，接种40 h 后无菌收取尿囊液，-80 ℃冻存备用。

1.2 实验动物 SPF 鸡与鸡胚，均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，鸡饲养在隔离器中。

1.3 主要试剂 dNTP、pMD18-T Easy Vector、DH5α 感受态细胞为TaKaRa 公司产品，购自北京百奥康生物科技公司；M-MLV、Random Primer、RNA 酶抑制剂，购自Promega 公司；2 ×PCR Mix，购自北京威格拉斯生物科技公司；TRIZol，购自Invitrogen 公司；引物合成自上海生工生物技术服务有限公司。

1.4 反转录 利用TRIZol 提取RNA，用于反转录制备cDNA。 反转录体系为20 μL，具体如下：5 ×Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、RNA 酶抑制剂1 μL、M-MLV 反转录酶0.5 μL、DEPC 水7.5 μL、Random Primer 1 μL、RNA 模版4 μL；37 ℃1 h，95 ℃5 min。

1.5 PCR 扩增及片段胶回收 利用设计的特异性引物配制PCR 体系，具体如下：cDNA 5 μL、20 μmol/L 上下游引物各1 μL、2 ×PCR Mix 25 μL、无菌双蒸水18 μL。 瞬时离心混匀后进行如下反应：94 ℃预变性5 min，94 ℃45 s，退火温度根据引物设定45 s，72 ℃1 kb/min，进行30 个循环，循环结束72 ℃10 min。 凝胶电泳鉴定后，胶回收目的片段。

1.6 PCR 产物克隆测序 按照pMD18-T Easy Vector 连接试剂盒说明书操作，阳性质粒送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

1.7 遗传演化分析 运用Lasergene 7.0、DNAMAN等分析软件对LN 株和国内其他流行株及经典疫苗株的序列进行比较分析。 应用MEGA5. 1 软件对LN 株、常用疫苗株与国内近年分离得到的IBV 的基因组序列进行遗传演化分析，绘制进化树。

1.8 致病性试验 将36 只SPF 鸡随机平均分成2组，一组通过滴鼻、点眼的方式攻毒，剂量为105EID50/0.2 mL，另一组作为空白对照。 攻毒后每天观察鸡只表现，记录临床症状，对死亡鸡只及时剖检，观察期为14 d。 攻毒后第3、5 天采集气管、肺脏、肾脏进行固定，用于病理组织学观察。

2 结果与分析

2.1 IBV 毒株的繁殖与复壮 将IBV LN 株接种10 日龄SPF 鸡胚尿囊腔，经连续传代6 代，已出现稳定胚变，表现为鸡胚矮小，蜷缩(见封二彩版图1)。 EID50经测定[4]为107.0EID50/0.2 mL。

2.2 PCR 扩增 利用设计的特异性引物，对基因组进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到LN 株共计29 个基因片段(图2)。

2.3 基因组序列分析 将PCR 扩增得到的各个基因组片段利用DNAStar 软件拼接获得LN 株基因组序列，共27，672 nt，将LN 株与国内外IBV 代表性毒株进行同源性分析。 结果显示，LN 株与传统疫苗H120、H52 株的同源性分别为86.3%和86.2%，与国内流行株QX 型IBV JS 株和SD 株同源性分别为96.2%、95.4%，与TW 型IBV GD 株的同源性为94.9%。

图2 IBV LN 株各片段PCR 产物电泳结果

将LN 株与国内外IBV 毒株进行序列对比并绘制进化树(图3)。 从图中可以看出，IBV 毒株可以划分为两个分支，Class Ⅰ分支为我国目前主要的流行毒株，LN 株属于此分支。 Class Ⅱ分支多为国外经典毒株与疫苗株，两分支进化关系较远。

图3 IBV 全基因组系统进化树分析

2.4 致病性试验 攻毒组在攻毒第4 天有1 只鸡出现张口呼吸症状，第5 天开始出现死亡，持续到第10 天，死亡高峰出现在第5 ～6 天，观察期间共死亡10 只，死亡率为56%。 LN 组鸡只剖检可见肾脏表面由少量尿酸盐沉积，气管有黏液。 死亡鸡只病理组织学观察可见气管黏膜上皮细胞脱落；支气管出血；肾脏间质淤血，淋巴细胞浸润，如封二彩版图4所示。 空白对照组未观察到明显的临床症状、剖检变化和病理组织学变化。

3 讨论

鸡传染性支气管炎是鸡的一种急性、高度接触性传染病，可侵害不同日龄的鸡群，是目前危害我国养禽业的主要疫病之一。 由于IBV 容易发生变异和重组，不断出现新血清学和基因型，且不同血清型毒株之间的交叉保护作用较差，因此了解不同地区分离毒株的血清型对于IB 的防控至关重要。 本研究对最近分离到的一株IBV 进行了序列测定，命名为LN 株，并分析了其与国内外流行株的同源性以及致病性。

通过将LN 株与国内外其他IBV 毒株进行基因组序列比对分析，我们发现LN 株属于QX 型IBV[1]，与常用疫苗株亲缘关系较远。 有研究表明，QX 型IBV 已成为我国目前的主要流行毒株[5]，而且QX 型IBV 与疫苗相关型强毒株IBV 在致病性上有较大的差别。 通过致病性试验，我们可以看出，IBV LN 株对3 周龄的SPF 鸡有较强的致病性，死亡率可以达到56%。 进一步提示了QX 型IBV 对我国养禽业有较大的威胁。 此次研究表明，QX 型IBV在基因组序列和遗传演化关系上与疫苗株有较大差异，且致病性较强，可能是造成免疫失败的原因之一，提示我们研发针对QX 型IBV 的疫苗是十分必要的。