微生物脂肪酶资源挖掘研究进展

蔡海莺，王珍珍，张 婷，赵敏洁，李 杨，毛建卫，冯凤琴,*

脂肪酶亦称酰基甘油水解酶，在自然界中主要催化三酰甘油酯的水解，还可在非水相条件下催化酯化、酯交换、醇解和酸解等反应[1-2]。脂肪酶目前在酶制剂中销量第三，仅次于糖酶和蛋白酶，其催化多样性和底物专一性等特征使其在粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业以及药物合成等许多领域得到广泛应用。脂肪酶可由动物、植物和微生物（包括霉菌、酵母及细菌）等各类生物细胞表达，它既可以从动物或植物的组织中提取，也能通过微生物发酵培养得到，而目前微生物是工业脂肪酶的主要来源[2]。另外，自从米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase，RML）的3D结构在1990年得到解析后（图1）[3]，微生物脂肪酶的结构研究已经比较透彻，它具有一些典型的结构及特征[1]：微生物脂肪酶结构属于典型的α/β水解酶折叠类；活性中心由催化三联体Ser-His-Asp/Glu组成；具有特殊氧阴离子洞结构，帮助维持酶-底物中间体的稳定；许多脂肪酶还具有盖子结构，与脂肪酶的界面激活相关。

图1 α/β水解酶折叠结构示意图（RML）Fig. 1 Schematic diagram of folded structure of α/β hydrolase (RML)

随着微生物脂肪酶工业化应用的不断发展，市场对酶制剂的各项性质和指标提出了更高的要求，如最适温度和pH值、较高的温度稳定性和酸碱耐受性、理想的催化活性和反应专一性、非常规溶剂（有机溶剂、离子液体等）的耐受性等。微生物脂肪酶基因和蛋白相关资源信息已经非常丰富，但适合食品、药品和能源等工业应用的脂肪酶制剂品种依然较少，研究者仍然在为新型和理想的脂肪酶制剂资源的挖掘而努力。研究的重点主要包括：1）通过环境筛选和宏基因组等方法不断挖掘新的具有优良特性的脂肪酶；2）通过诱变等传统的微生物遗传育种方法改良脂肪酶生产菌株；3）构建重组工程菌株在模式微生物中异源表达脂肪酶基因，以提高脂肪酶表达效率；4）优化产脂肪酶菌株的发酵表达工艺以及下游分离纯化工艺，提高酶的表达量和得率；5）利用定向进化和理性设计等分子生物学手段对酶蛋白进行改造，改善脂肪酶的理化性质和催化性质；6）通过酶固定化以及改善酶催化反应条件提高脂肪酶的催化效率和利用效率。

1 产脂肪酶微生物筛选

与其他水解酶类相比，脂肪酶催化的反应类型和条件更加多样化，而不同类型脂肪酶的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和pH值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质，所以筛选到合适的脂肪酶及其编码基因是脂肪酶研发的重要基础。脂肪酶在自然界分布广泛，由于筛选技术和体系的完善和成熟，从环境筛选产脂肪酶微生物已经相对容易。但是要获得具有理想催化性质和理化性质的脂肪酶，往往还依赖于高效的筛选方法和针对性的微生物样品来源。

1.1 产脂肪酶微生物的环境筛选

产脂肪酶微生物几乎无处不在，考虑到自然界对产脂肪酶微生物的天然富集作用，脂肪酶的表达主要受环境因子的调节，产脂肪酶微生物需要以油脂和脂肪酸作为碳源生长，因此常用的微生物筛选来源包括油脂加工厂、乳制品工厂以及附近被油脂污染的土壤和水域等。

脂肪酶区别其他水解酶类的一个显著特征是许多脂肪酶的催化合成反应要求在非水相条件进行，这对脂肪酶稳定性方面提出了更高要求。Ogino等[4]认为从有机溶剂耐受性较高的微生物中筛选到的酶，更可能具有有机溶剂耐受性，他们将采集的微生物样品在含20%有机溶剂的培养基中富集培养后，最终筛选到来源于Pseudomonas aeruginosa LST-03菌株的具有一定有机溶剂耐受性的脂肪酶。此后，陆续有各种具有高稳定性和耐受性的脂肪酶被筛选获得的报道，产脂肪酶微生物样品来源也扩展到一些极端环境（表1），如热温泉、火山、海底和冰川等[5]。Stathopoulou等[6]从希腊爱琴海的圣托里尼火山区域分离到101 株细菌，其中9 株菌株能分泌胞外脂肪酶，进一步的酶失活实验表明这些脂肪酶大部分具有很强的热稳定性。

表1 极端环境产脂肪酶微生物筛选Table 1 Lipase-producing microorganisms from extreme environments

1.2 产脂肪酶微生物筛选方法

产脂肪酶微生物的筛选方法必须具有快速、简洁，并适合大规模筛选的特点。由于脂肪酶催化反应和底物的多样性，脂肪酶活性可以通过多种方法检测。产脂肪酶微生物的筛选方法均由脂肪酶酶活力检测方法发展而来，常见的筛选方法有透明圈法、变色圈法和荧光圈法。透明圈筛选法原理是利用微生物分泌的脂肪酶水解该菌落周围培养基中乳化的甘三酯底物产生甘油和对应脂肪酸，使原本不透明的甘三酯底物转化为透明产物，从而形成以菌落为中心的透明圈[17-18]。变色圈法和荧光圈法与透明圈法原理相似，不同的是还需在培养基中添加能与水解产物游离脂肪酸反应的显色指示剂，如罗丹明B、维多利亚蓝等。罗丹明B阳离子能与水解产物脂肪酸形成荧光物质，在紫外光照射下显示荧光，从而达到产脂肪酶微生物筛选的目的[19]。

随着分子生物学的发展，对脂肪酶进行蛋白工程改造的研究越来越成熟，也出现了许多脂肪酶高通量筛选方法，如Jaeger等[20]以对硝基苯酚酯（常用的包括丁酸酯和棕榈酸酯等）为底物，筛选能拆分R和S型底物的立体选择性脂肪酶。虽然理论上脂肪酶催化水解和酯化互为可逆反应，但是脂肪酶的水解活性和合成活性并非对等的，水解活性高的脂肪酶在非水相溶剂中展示的合成活性不一定高。因此，传统的以水解活性为依据的筛选方法对于筛选具有酯化合成能力的脂肪酶存在一定在风险。基于脂肪酶在各种合成反应中的重要地位，研究者建立了一系列非水相中脂肪酶酯催化合成能力筛选和评估方法。Furutani等[21]通过测试24 种反应体系中脂肪酶活力，发现这些脂肪酶酯化合成活力能以体积分数50%正己烷溶剂条件下水解油脂底物的活性来表征。Goujard等[22]建立了分光光度法测定脂肪酶转酯活性，通过硬脂酸乙烯酯和醇在非水相条件下的转酯反应，在200 nm紫外光下测定吸光度检测硬脂酸乙烯酯底物的消耗量，换算脂肪酶的转酯活性。这些不断涌现的新脂肪酶活力测定和筛选方法，对新型脂肪酶的发掘、制造和应用有非常重要的作用，同时也推动了脂肪酶的蛋白工程改造和分子改造研究。

1.3 宏基因组文库筛选

由于地球上微生物种类多样，目前大部分种类很难分离和培养，在很多环境中，多达99%的微生物种类很难以标准化方式培养，包括许多极端环境的微生物。因此，以传统的平板分离法分离具有解脂活性的产脂肪酶微生物将会丢失许多脂肪酶资源。宏基因组是指特定环境中全部微小生物基因组DNA的总和，又称为环境基因组[23-24]。随着宏基因组和微生态相关技术的发展，研究者能够突破环境微生物分离和培养的瓶颈，极大限度地增加了环境微生物脂肪酶资源的利用潜能。

利用宏基因组筛选脂肪酶的方法主要包括两种：基于功能的脂肪酶筛选和基于DNA序列的筛选。基于功能的脂肪酶筛选需要对收集的样品宏基因组DNA进行宏基因组文库的构建。构建的文库经异源表达系统诱导表达后，在平板上对其功能性进行筛选鉴定，对有脂肪酶活性的克隆进一步分析，以获得该脂肪酶的编码基因。Glogauer等[25]从高油脂污水中提取宏基因组DNA，通过以甘三酯为底物的功能性筛选平板建立的文库中筛选了500 000 个克隆，获得了32 株具有脂肪酶基因的克隆。Yan Wei等[26]从热温泉提取宏基因组DNA，通过人工染色体载体构建基因文库，在获得的68 352 个克隆中筛选到具有能表达三丁酸甘油酯水解活性的新型脂肪酶基因lip-1。然而，基于功能的筛选方法缺点显而易见，即活性克隆比例通常在1/10 000水平，筛选效率十分低下且耗时耗力[27]。另外，异源表达系统还可能导致许多脂肪酶基因因低表达或不能功能性表达而被遗漏。

基于DNA序列的宏基因组筛选方法主要是指根据脂肪酶基因高度同源序列设计合适的简并引物，用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增出潜在的脂肪酶编码序列。脂肪酶保守区域包括Ser亲核肘以及氧阴离子洞等脂肪酶特有结构。然而，基于序列的筛选同样具有许多问题，如只能得到部分脂肪酶基因，需要染色体步移和热不对称交错PCR等辅助手段获得全长。并且该方法要求合适的PCR条件，复杂多样的模板以及引物模板的低匹配程度都可能导致PCR无法获得理想产物，也意味着很难发现具有不同序列结构的新脂肪酶家族基因。对构建文库的功能性筛选和基于生物信息学分析的筛选是两种优势互补的宏基因组技术手段。随着测序技术和基因注释的不断丰富和完善，人们从宏基因组文库中获得新的脂肪酶基因概率也不断提高。

2 脂肪酶生产微生物菌株遗传改良

一般情况下，微生物自身的生存和代谢调控都遵循经济的原则，即以最小的消耗获得有利于自身发展的最大效益，但这并不符合人们对其作为细胞工厂高效表达目的产物的定位。通过诱变这一传统的微生物遗传育种方法能够改良脂肪酶生产菌株，实现酶产量的大幅提高。诱变育种的原理是通过造成遗传物质DNA的损伤而达到生物突变，常用的诱变方法包括物理诱变法（紫外线、等离子体、X射线、γ射线和其他射线处理等）、化学诱变法（烷化剂、吖啶、亚硝酸、叠氮化物和甲基磺酸乙酯等）以及二者组合的复合诱变。如Mahadik等[28]采用紫外线处理诱变产脂肪酶黑曲霉菌株，使其产量较出发菌株提高了7 倍。

传统的诱变方法是通过微生物基因组DNA的突变提高目的蛋白脂肪酶活力和表达量，其可能机理主要包括：1）突变促进了微生物细胞生长，缩短了细胞分裂周期，去掉了不利的代谢通路；2）突变提高了细胞对蛋白（胞外酶）的分泌效率；3）降低了细胞对蛋白表达转录水平的阻遏，使目的蛋白不受某些转录因子的负面调节；4）突变导致部分蛋白酶（尤其是胞外蛋白酶）的活力降低甚至失活，使目的蛋白有效积累；5）直接作用于目的蛋白的突变，使表达量或比酶活力提高，如提高启动子效率或改善酶的立体结构和催化性质。赵兴秀等[29]采用紫外线诱变、微波诱变和紫外微波复合诱变多种方式处理出发菌株H3，结果表明，经微波辐射40 s和紫外线照射80 s复合诱变后筛选到的菌株M3产酶活力最高（61.6 U/mL），比出发菌株H3提高了46.85%。贾佳等[30]用亚硝基胍对初始菌株黑曲霉G27原生质体进行诱变，经过初筛、复筛和验证实验获得2 株脂肪酶活力显著提高的突变菌株P316和P388，酶活力分别达394.3 U/mL和385.1 U/mL。尽管越来越多的突变方法和筛选体系被发明和完善，传统诱变的方法对于酶产量的提高仍然是低效的，因为与酶表达相关的基因只是微生物基因组中成千上万基因中的少数几个。因此，传统诱变更适合用于与未知的、复杂的代谢途径相关的代谢产物或表观性状的遗传改良。然而，对质粒等小DNA分子进行诱变能提高改良效率，可作为定向进化的辅助手段。另外，Zhang Xue等[31]利用常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）处理脂肪酶蛋白的研究表明，经过ARTP处理的脂肪酶的活力有所升高，进一步通过圆二色光谱分析发现，经处理后的脂肪酶的二级结构发生了明显变化；表明诱变可直接作用于生物活性物质，通过对酶结构的改变改善酶的催化性质，为酶工程提供了新的研究方向。

在模式微生物中异源重组表达脂肪酶基因，是提高脂肪酶表达效率和降低生产成本的另一个有效手段。重组表达系统表达脂肪酶具有多种优势：重组表达系统大多具有高效表达脂肪酶的能力；重组表达的宿主遗传背景清晰，易于分子改造；模式生物的表达体系成熟，易于培养和调控，发酵周期较短，培养成本低；很多表达系统如酵母和丝状真菌表达系统具有很强的分泌能力，能将脂肪酶分泌到胞外，易于下游的分离纯化和制剂化（固定化）等操作等。目前，多种重组表达系统被用于脂肪酶的异源表达，其中多种商业化脂肪酶也来源于重组宿主，如诺维信公司的RML主要来源于米曲霉表达系统。另外，GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用卫生标准》中批准的3 种用于食品工业的脂肪酶制剂添加剂[32]可由特定重组表达系统生产，如南极假丝酵母脂肪酶基因可由黑曲霉宿主表达，尖孢镰刀菌脂肪酶基因可由Aspergillus oryzae重组表达。脂肪酶的克隆和重组表达方面的研究更是不胜枚举。徐苏炜等[33]将编码RML的基因克隆到pPIC9K载体中，转化到Pichia pastoris GS115菌株，G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌，以橄榄油为底物时，发酵上清液酶活力最大可达102 U/mL。苗长林等[34]通过反转录-PCR扩增出RML结构基因，并转化到P. pastoris GS115菌株进行甲醇诱导表达。结果表明，重组子发酵液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析获得了与预期分子质量大小（约39 kDa）一致的蛋白表达特异条带，用NaOH溶液滴定法测其活力，酶活力可达84 U/mL。另外，Zheng Yayun等[35]从Thermomyces lanuginosus HSAUP0380006克隆了该菌株的脂肪酶基因，构建了该基因在P. pastoris的重组表达工程菌，通过甲醇诱导表达，发酵上清液水解橄榄油酶活力最高可达61 U/mL。

另外，在基因工程菌异源表达中，多种基因表达的优化方法被用于进一步提高脂肪酶基因的表达水平，包括：提高基因拷贝数，替换成强启动子，表达框中加入增强子，加信号肽使酶分泌到胞外，共表达分子伴侣和前导肽，对基因序列（如密码子、密码子对等）进行优化、融合表达和共表达，选择合适的工程菌宿主（如蛋白酶缺陷型菌株）和优化发酵工艺以及下游分离纯化工艺提高酶的表达量和得率等。这些优化方法并非独立存在，相反，将它们有机结合才可能实现酶异源表达的最大化。如杨江科等[36]探讨了脂肪酶前导肽以及密码子优化对脂肪酶表达以及性质的影响，采用重叠延伸PCR技术将基因中8 个低频密码子替换为高频密码子后，在摇瓶条件下发酵72 h，发现经密码子优化后的成熟米根霉脂肪酶（mature Rhizopus oryzae lipase，m-ROL）活力和蛋白质含量分别达到132.7 U/mL和50.4 mg/mL，而初始m-ROL和含前导肽米根霉脂肪酶（pro-ROL）活力和蛋白质含量分别仅为28.7 U/mL和14.4 mg/L、29.6 U/mL和14.1 mg/L。

3 脂肪酶的蛋白质工程

目前能用于工业化的微生物脂肪酶的种类还十分有限。利用蛋白质工程的方法对现有脂肪酶蛋白进行分子定向改造，来改善脂肪酶的理化性质和催化性质，是拓宽酶工程研究领域和获得理想酶制剂的重要手段之一。分子改造的方法主要分为定向进化、理性设计和二者相结合的半理性设计[37]。

3.1 脂肪酶定向进化

定向进化是指模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合人类应用价值的蛋白突变体[38-39]。定向进化与自然进化都遵循试错法的策略，通过不断的实验尝试获得符合预期的突变体。由于定向进化不需要获得蛋白的高级结构以及催化位点等结构，因此只须对蛋白氨基酸序列做随机突变，这是蛋白质工程的重要研究手段。定向进化的核心步骤主要包括两部分，即构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。

随着基因工程手段的丰富，构建突变体文库的方法也越来越多。常用的包括：易错PCR、DNA改组、交错延伸过程、随机引导重组、截断状模板重组延伸等[40]。但是每种方法都有自身的优点和缺点，在构建突变体文库时，只有根据蛋白基因、筛选目的和实验条件等综合考虑，选择适合自己实验的突变方法，获得多样化且突变率或重组率合适的基因突变体文库，才能通过高通量筛选方法获得定向进化的酶突变体。

同样，建立高通量的筛选方法，从海量的突变基因文库中快速、灵敏、高效地获得符合需要的突变体，也是酶定向进化获得成功的关键因素。由于筛选方法会因筛选蛋白和筛选目的的变化而不同，因此高通量的筛选方法的缺乏一直限制着定向进化的进一步应用。但随着定向进化和蛋白质工程相关技术的飞速发展，酶突变体文库高通量筛选方法也不断出现，如细胞表面展示技术、噬菌体展示技术、核糖体展示技术以及细菌和酵母胞外表达筛选方法。筛选形式也渐渐从灵敏度较低和不能定量检测的平板观察法转移到更加灵敏、可靠、高效且适于自动化的微孔板筛选法和流式细胞仪筛选。利用定向进化技术构建脂肪酶突变体库和高通量的筛选方法已十分成熟，也已获得大量活性、热稳定性、溶剂耐受性或底物选择性改良的脂肪酶突变体。Liebeton等[41]用易错PCR对Pseudomonas aeruginosa脂肪酶进行迭代随机突变，获得的最佳突变体含5 个突变氨基酸，对筛选底物2-甲基月桂酸对硝基苯酚酯的手性选择性提高了23.45 倍。Zhang Ningyan等[42]同样通过易错PCR的迭代随机突变方法对南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）进行定向进化，筛选得到的两个脂肪酶突变体23G5和195F1在70 ℃温度下的半衰期较野生CALB提高了20 倍。酶的定向进化技术成功实现了对酶结构的改造，从而改造了酶的催化功能和性质，使酶的应用成本显著降低，应用范围不断扩大。然而，考虑到每种酶蛋白往往有几百个氨基酸，每种氨基酸可能被其他19 种氨基酸替代，而酶的定向进化是建立在随机突变和重组的基础上进行筛选；因此，定向进化往往需要建立巨大的突变文库，筛选过程需要大量的人力资源和时间，且能筛选到的阳性突变体非常少。

3.2 脂肪酶理性设计

与定向进化的非理性设计策略不同，理性设计是根据已知脂肪酶的三维结构和催化机理，分析酶结构和功能间的构效关系，并针对性地替换或修饰某些氨基酸残基，以精确调控蛋白的高级结构，从而获得具有预期催化性质和理化性质的酶蛋白。理性设计需要许多与蛋白质结构与功能相关的信息作为设计理论基础和指导，可简单分为基于实验的理性设计、基于酶保守序列的理性设计、基于计算机辅助和从头设计的理性设计。

基于实验的理性设计并无统一策略，设计能否改善酶蛋白主要取决于对酶构效关系的掌握程度，主要方法包括特定位点（如活性中心、底物结合位点等）的突变和脂肪酶盖子结构改造等。Secundo等[43]基于对脂肪酶盖子结构功能的了解，对褶皱假丝酵母脂肪酶和假单胞菌的盖子结构进行改造，获得了酶活性和底物特异性变化的突变体。同时在枯草芽孢杆菌脂肪酶A脂肪酶中插入盖子结构，使其酶活性、特异性、立体选择性和稳定性都发生改变。

基于酶蛋白保守序列和保守结构的理性设计是通过搜索和比对同源性酶的保守序列，从而对影响蛋白的关键残基进行预测和改造。随着生物信息数据库中蛋白序列及结构信息的增多，基于序列和结构信息的理性设计的应用也越来越有效，通过比较不同来源同工酶的序列和结构信息，能针对性地改造酶的催化特性和理化特性。有人提出假设，酶的保守序列比非保守序列更有利于酶的稳定性，因此将不影响蛋白活性的非保守氨基酸替换成保守氨基酸有利于提高酶的稳定性。

较基于实验和序列的传统理性设计方法，计算机辅助设计更加高效、合理，并具有广泛适用性，已成为酶理性设计的主要研究方向。计算机辅助设计是通过引入计算机算法对酶、配基、底物和溶剂分子等体系进行分析、计算、模拟，在此基础上精确预测和调控关键残基，从而根据需要对酶的结构进行理性设计和改造。计算机辅助设计同样需要了解和利用酶的催化机理和规律，包括酶活性中心的底物结合口袋与底物的锁钥模型、酶催化等过渡态中间体理论等；研究还发现进入底物口袋的通道形状和大小对酶的活性和底物专一性有显著影响。这些规律都能为酶的理性设计提供依据，有助于在模拟结果中选择最合适的突变体。Takwa等[44]通过理性设计对CALB的底物口袋进行改造；发现底物口袋增大的突变体Q157A和Q157A/I189A/L278A有利于提高大体积底物丙交酯开环聚合反应速率，催化反应活性提高了90 倍。Ema等[45]根据酶与底物过渡态结合模拟的结果，对洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的手性选择性进行改造，通过修饰酶与R和S型底物的空间位阻获得手性选择性E值大于200的突变体I287F/I290A。Marton等[46]通过对脂肪酶CALB进入活性中心的通道进行改造，发现影响底物通道大小和形状的氨基酸残基的定点突变（L278V、I189A和A282L），都能影响脂肪酶对仲醇类底物的偏好性。理性设计的方向还包括德拜-沃勒因子对蛋白稳定性的设计，高级结构中各种作用力对结构的影响等。酶的计算机辅助设计历史并不长，目前已成功改造出许多高效的酶突变体。随着生物信息学各类计算机算法和组合涌现，酶工程将进入信息时代。

从头设计成是新酶设计的一种手段，可以设计出自然界不存在的酶蛋白，甚至创造出能催化自然界不存在的反应的酶[47-48]。从头设计的基本思路如下：根据量子力学算法，设计酶和底物过渡态结构并建立理论活性中心的模型；通过软件从数据库中筛选出现存的可能容纳该理论活性中心的蛋白结构骨架；将理论活性中心的关键残基引入到筛选到的匹配蛋白骨架宿主中；进一步根据催化反应机理和过渡态理论，通过对相关氨基酸残基的改造优化活性中心和蛋白骨架在电子分布和立体结构上的相容性；通过Rosetta energy经验标准对设计酶进行排序，选择排名靠前的进行基因克隆、重组表达以及功能和活性鉴定，获得从头设计的新酶；最后还能通过定向进化等手段来进一步改善设计酶的活性和稳定性等。华盛顿大学Jiang Lin等[47]通过从头设计获得了能催化双烯加成反应的新酶；耶鲁大学的Alexandrova等[49]也成功设计出能催化Kemp消除反应的新酶。脂肪酶所属的α/β水解酶包含多种酶类，为新脂肪酶的设计提供了有利的现实条件。

从头设计中的设计、优化和筛选整套过程基本上都能在计算机上实现，实验验证部分较少，因此可以显著降低实验成本。另外，酶的从头设计非常有助于人们理解酶的催化机制，然而，人工设计酶普遍活性不高、设计成功率低。目前限制酶从头设计发展的主要因素是对酶催化机制和构效关系等信息的匮乏，随着量子力学、分子力学、分子动力学、结构生物学、生物化学等多学科交叉的酶催化体系科学的建立，以及计算机技术和算法的飞速发展，酶的从头设计将越来越可行。

尽管理性设计获得了许多成功的案例，但由于蛋白质结构的复杂性以及相关生物信息的匮乏，人们对各种突变效应和构效关系尚缺乏一个有效的解释机制，因而完全的理性设计成功率往往较低。半理性进化是指在计算机模拟或实验结果的支持下，获得可能的有益突变位点，在定向进化的基础上引入理性设计的成分，构建压缩的突变文库，大大缩小了突变的库容量，也避免了定向进化策略的突变文库量大、阳性突率低、筛选效率低下等问题[37]。另外，对于结构信息了解有限的蛋白质，半理性设计结果更为高效和可靠。Koga等[50]利用组合饱和突变对Burkhorderia cepacia脂肪酶底物结合口袋的4 个位点氨基酸进行半理性设计改造，筛选到对应选择性完全改变的突变体，从野生型的S型底物选择性变为R型选择性。利用计算机辅助等理性设计方法对酶进行分子改造，无疑是蛋白质工程的重要发展方向。

4 脂肪酶固定化和优化

4.1 脂肪酶固定化方法

酶的催化体系包括催化剂、底物、产物以及反应媒介。蛋白质工程是对生物催化剂酶的改良手段之一，其他手段同样也能对酶的催化性质等进行改良，如脂肪酶的固定化、酶的化学修饰等。固定化对脂肪酶应用非常重要，不仅因为与酶粉比较，固定化酶具有传质效率高，稳定性高，有利于酶回收、再利用和产品纯化等讨论较多的益处[51-52]，而且可能显著增加酶的催化活性，尤其是在非水相系统，这可能归因于脂肪酶固定化能够改变酶的构象，使其处于激活的状态[53-54]。最常见的脂肪酶固定化方法有4 类：吸附法、共价法、包埋法和交联法。其中，吸附法因其操作简单，能显著增强脂肪酶活性而在脂肪酶固定化领域应用最多[53,55]。吸附法主要通过物理或化学过程将酶装载到载体颗粒上将酶固定。脂肪酶的吸附固定化载体需要一定的作用力维持，常见的吸附方式包括疏水作用力、离子相互作用等。因为固定化载体对脂肪酶固定化效果起着决定性作用，因此对脂肪酶吸附法固定化的研究主要集中在固定化材料方面，包括树脂类型、颗粒大小、孔径大小、形状、机械强度、亲疏水性、官能团种类等[56]。共价法是指酶蛋白分子基团和固定化材料表面的基团之间以化学反应形成共价键而相互结合，形成固定化酶的方式[57]。共价结合法形成的固定化酶结合牢固，在剧烈的反应条件下也不会因发生酶和载体分离而导致酶泄漏或释放，具有强的稳定性且能多次重复使用[58]。但是酶蛋白分子上的共价修饰可能引起脂肪酶结构和功能的改变，导致酶活性和催化效率的下降。另外，酶蛋白上能供选择的被共价修饰的基团非常有限，也阻碍了共价结合在脂肪酶固定化上的应用。包埋法是在聚合剂的作用下，在聚合物单体聚合成多聚物高分子的过程中，将酶蛋白包埋在聚合物的固定化方法[59]。由包埋法固定的脂肪酶结构稳定，酶分子不会泄漏，但是反应体系中底物与酶接触困难，传质效率很低。交联法指通过双功能或多功能的交联剂（如戊二醛）使酶蛋白通过共价键间接交联的酶固定化方法[60]。交联酶属于无载体固定化酶，类似的固定化酶还有交联酶聚集体以及交联酶晶体。因为无载体固定化酶颗粒主体为酶蛋白，相较于载体固定化酶具有较高的比酶活力；但制作过程较为繁琐，且颗粒较小，导致回收困难，通常该方法与其他固定化方法结合使用[53]。

4.2 新型脂肪酶固定化技术

酶固定化后催化活性降低可能是因为酶在固定化载体上无序排列和附着使酶的催化活性位点无法接触到底物，酶的定向固定化技术是基于上述假设提出。酶的定向固定化可使酶蛋白活性中心背离载体的干扰，降低与底物分子结合的空间位阻，从而提高酶催化效率。Godoy等[61]利用定向固定化技术获得定向的固定化Geobacillus thermocatenulatus脂肪酶，这些脂肪酶的对映体选择性大幅提高。

细胞表面展示技术也能用于脂肪酶的固定化，不同的是载体是微生物细胞。细胞表面展示脂肪酶的研究有许多，还有在同一宿主上共展示不同脂肪酶，以提高催化底物的范围[37]。表面展示技术的难点是开发兼容性好的细胞表面锚定蛋白，将目的蛋白高效地展示在细胞表面。表面展示的脂肪酶和全细胞催化在生物柴油的合成等领域的应用研究正在开展，具有良好的应用前景，但离工业化应用还有较大差距。

4.3 脂肪酶制剂化因素优化

酶固定化和其他制剂化过程对酶制剂质量也有很大影响，如冷冻干燥过程中加入酶的保护剂蔗糖、氨基酸、盐和多元醇等，可最大程度保持酶的结构和功能稳定。冷冻保护剂在冻干过程中能取代水分子与酶蛋白形成氢键以保持酶的构象，保护剂的极性也能对酶蛋白结构的改变和酶活损失进行改善。另外，脂肪酶的界面激活效应使酶具有两种形态，通过分子印迹的手段能使脂肪酶保持在激活的状态，因为具有分子印迹作用的表面活性剂分子具有两亲基团，类似于油-水界面，使脂肪酶的盖子结构从活性中心上方打开。而有机溶剂中的刚性环境很难让脂肪酶结构发生变换，从而保留了脂肪酶这种有利于催化的活性状态。同样，冻干过程中的缓冲液的pH值和离子强度也会影响最终酶制剂的催化效率。脂肪酶在有机溶剂中的最适pH值与在水相中的基本一致，在制剂化过程中保持原有的最佳离子化状态，有利于提高最终催化剂的活性，在非水相刚性环境中，酶的结构能持续保持在适合催化的状态。

我国工业和信息化部于2016年7月18日发布《工业绿色发展规划（2016—2020年）》，意味着我国对环境保护的重视和举措又上新的台阶，因此迫切需要加快绿色工业制造体系的发展。酶制剂作为绿色生物催化剂，在食品、药品、能源、环保和农业技术等多个领域的需求和关注与日俱增。脂肪酶是酶制剂中效率第三的酶类，但商业化脂肪酶制剂的进一步工业化应用一直受生产和使用成本的限制。本文从新型微生物脂肪酶制剂资源的挖掘出发，综述现有的脂肪酶研发途径和重点方向，主要包括产脂肪酶微生物的环境筛选、宏基因组筛选挖掘新的具有优良特性的脂肪酶、脂肪酶微生物生产菌株的诱变育种和改良、脂肪酶基因在重组工程菌株中的重组表达和优化、蛋白质工程方法对脂肪酶蛋白进行改造以及脂肪酶固定化和催化工艺的改良等，对脂肪酶制剂和其他酶制剂的开发具有一定的指导意义。

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