泽漆中金丝桃苷的提取工艺

陈 健，王 丹，Aun Raza，汤 建，欧阳臻

(江苏大学 药学院，江苏 镇江 212013)

泽漆 (EuphorbiahelioscopiaL.)，又名猫眼草、五朵云等。一年生或者两年生草本，高10～30 cm，全株含有白色乳汁。泽漆生于川泽，茎梗小，有叶，花黄，四五月采之[1]。临床用于治疗腹水、水肿、肺结核、颈淋巴结核、痰多喘咳、癣疮，民间还用于治疗宫颈癌、食道癌等[2]。早前的研究主要关注二萜酯类化合物及其生物活性。近年来报道泽漆含有丰富的槲皮素及槲皮素为母核的黄酮苷类化合物，其中金丝桃苷(hyperoside)是主要的黄酮苷类成分之一[1-2]。金丝桃苷具有保肝、神经保护、抗炎症、抗癌、抗氧化应激、抗微血栓形成及对保护心脑缺血损伤的药理作用，且无遗传毒性[3]。目前市场上提供的金丝桃苷以植物提取为主[3-4]，因此发现富含该化合物的植物资源，建立高效环保的制备金丝桃苷的工艺，对于深入研究该化合物具有实际意义。

前期研究中发现野生植物泽漆中含有丰富的金丝桃苷及2''-O-没食子酰基金丝桃苷(2''-O-galloyl hyperoside)，并且植物资源丰富，价格低廉[5]。2''-O-没食子酰基金丝桃苷在碱性条件下可以水解失去没食子酰基变为金丝桃苷，采用NaOH溶液处理泽漆药材可以方便地制得金丝桃苷。本文旨在采用正交试验优化泽漆中金丝桃苷的提取工艺，为金丝桃苷的工业化生产提供依据。

1 材料与仪器

泽漆药材于2015年4月收集于江苏镇江，经本院欧阳臻教授鉴定为大戟科大戟属植物泽漆(EuphorbiahelioscopiaL.)。泽漆地上部分干燥，粉碎至10～20目，冷藏备用。金丝桃苷对照品为本实验室自制；甲醇(色谱纯)、双纯水；其他试剂及化学品为分析纯。

Sartorius电子天平；LC-20A高效液相色谱仪(Shimadzu)。

2 实验方法

2.1 HPLC-UV分析[6]

色谱柱为Gracesmart RP-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μmol/L)；流动相为甲醇-水(40∶60)；流速：0.8 mL/min；柱温：20 ℃；检测波长：360 nm；进样量20 μL。

精密称取4.9 mg金丝桃苷用乙醇溶解，配成浓度为0.49 mg/mL的溶液，逐级稀释制备系列浓度的标准品溶液。HPLC测得峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)制备标准曲线。所有样品10 000 r/min离心3 min，取上清液进样。

2.2 单因素考察[7]

2.2.1 溶液pH值的考察

4份样品(0.5 g)中分别加入9 mL，8.5 mL，8 mL和7.5 mL 30%乙醇，再依次加入不同体积0.4 mol/L NaOH乙醇溶液(乙醇浓度30%)，最后用30%乙醇补至终体积10 mL， pH值分别为8，9，10，11。在液料比20∶1，25 ℃条件下浸渍12 h，过滤，滤液用5%盐酸调pH 5～6，静置备用。

2.2.2 液料比的考察

4份样品(0.5 g)中分别加入体积为5.5 mL，8 mL，10.5 mL，13 mL(液料比15∶1，20∶1，25∶1和30∶1)的30%乙醇，再加入不同体积0.4 mol/L NaOH乙醇溶液(乙醇浓度30%)，最后用30%乙醇补至终体积分别为7.5 mL，10 mL，12.5 mL和15 mL。在pH 10，25 ℃条件下浸渍12 h，过滤，滤液调pH 5～6，静置备用。

2.2.3 浸渍时间的考察

4份样品(0.5 g)中依次加入8 mL 30%乙醇和0.4 mol/L的NaOH乙醇溶液(乙醇浓度30%)，最后用30%乙醇补至终体积10 mL。在pH 10，液料比20∶1，25℃条件下分别浸渍8 h，10 h，12 h和14 h，过滤，滤液调pH 5～6，静置备用。

2.2.4 浸渍温度的考察

4份样品(0.5 g)中依次加入8 mL 30%乙醇和0.4 mol/L的NaOH乙醇溶液(乙醇浓度30%)，最后用30%乙醇补至终体积10 mL。在pH 10，液料比20∶1条件下，分别于10 ℃，25 ℃，40 ℃和55 ℃温度下浸渍12 h。过滤，滤液调pH 5～6，静置备用。

2.3 正交试验优选泽漆中金丝桃苷成分的提取工艺[8]

2. 3.1 正交试验表设计

从pH值(A)、液料比(B)、浸渍时间(C)以及浸渍温度(D)四种因素中，选择三种因素进行L9(34)正交试验考察，以金丝桃苷的含量为考察指标，进行提取工艺优化。

2. 3.2 供试品溶液的制备

精密称取9份药材粉末，每份0.5 g，放入提取管中，每三管一组，按组分别加入不同体积30%乙醇溶液和0.4 mol/L NaOH乙醇溶液(乙醇浓度30%)，按照正交试验设计进行提取，提取液过滤，调pH 5～6，静置备用。

3 结果与讨论

3.1 HPLC-UV分析

金丝桃苷的线性回归方程y=32 483 986x-693.354，r=0.999 7，结果表明金丝桃苷浓度在1.12～147.00 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.2 单因素考察

3.2.1 溶液pH值的影响

在液料比20∶1、浸渍时间12 h条件下，考察pH对金丝桃苷提取率的影响。发现在溶剂pH 10左右时，药材中的金丝桃苷(1)含量明显增加(如图1)，而超声10 min的30%乙醇提取液中，2''-O-没食子酰基金丝桃苷(2)的含量远高于金丝桃苷。

根据图2(A)可知，pH 9～11的30%乙醇溶液提取金丝桃苷有较高得率，且pH值对金丝桃苷的提取率影响非常显著，但pH 11条件下金丝桃苷含量开始下降。

3.2.2 液料比的影响

pH 10，浸渍时间为12 h，考察液料比对提取的影响，其结果如图2(B)所示。由图2可以看出，当液料比达到20∶1后，提取金丝桃苷的量趋于稳定。故选择20∶1的液料比进行下一步操作。

图1 样品HPLC图(A: 泽漆30%乙醇提取液； B: 泽漆30%乙醇(pH10)提取液；

3.2.3 浸渍时间的考察

pH 10，液料比为20∶1的条件下，考察浸渍时间对提取金丝桃苷的影响，其结果如图2(C)所示。由图可知，浸渍时间达到12 h，提取金丝桃苷的量趋于平稳。故下一步操作中药材浸渍12 h。

3.2.4 浸渍温度的考察

pH 10，液料比为20∶1，浸渍12 h的条件下，考察浸渍温度对提取率的影响。其结果如图2(D)所示。由图可知，温度对金丝桃苷的提取率具有一定影响，55 ℃条件下，金丝桃苷的含量明显下降，而25 ℃和40 ℃条件下，金丝桃苷提取率基本一致。结合预试验结果，正交试验中选择25 ℃为浸渍温度。

图2 四种因素对金丝桃苷提取率的影响

3.3 正交试验优选泽漆中金丝桃苷成分的提取工艺

3.3.1 正交试验表设计

在单因素试验基础上选择pH值(A)、液料比(B)和浸渍时间(C)三种因素设计正交试验，以确定最优提取工艺。以金丝桃苷为考察指标，正交试验设计见表1。

表1 优选泽漆中金丝桃苷提取工艺正交试验因素水平

根据单因素实验可知，溶剂pH值、液料比和浸渍时间的选择区间分别是9～11，15∶1～25∶1，10～14 h，浸渍温度设定25 ℃。

3.3.2 正交试验结果

表2 正交试验设计表及直观分析结果

表3 正交试验方差分析

由表2、3直观分析及方差分析，影响提取工艺的因素顺序为A>B>C，其中pH值(A)对提取有最大影响且有显著性意义。同时从金丝桃苷含量来看应该选择A2B2C2，即在25℃，pH 10，液料比20∶1，浸渍12 h为实际最佳工艺条件。

同时还考察了超声对金丝桃苷提取效率的影响，发现在液料比1︰20，pH为10条件下，药材先浸渍10 min，再分别超声5 min，10 min，15 min，生药材中的金丝桃苷提取率分别为27.56%，38.85%，55.79%。随时间的延长，提取液中金丝桃苷的含量并未显著增加，并且超声15 min后仍有35%左右的2''-O-没食子酰基金丝桃苷存在。

4 结 论

目前关于金丝桃苷的原料来源主要是藤黄科植物(贯叶连翘)、蔷薇科植物(山楂)、鹿蹄草科(鹿衔草)、锦葵科(黄蜀葵)等[4]，但我们发现野生植物泽漆中含有丰富的金丝桃苷及其没食子酰基衍生物，并且资源丰富，药材价格低廉。最优条件下所得提取液经HPLC分析，金丝桃苷的提取率达2.286 mg/g，较生药材中的含量(1.197 mg/g)有大幅提高，而2''-O-没食子酰基金丝桃苷基本消失。这是因为没食子酰基衍生物在提取过程中水解(pH 10)而变为金丝桃苷的缘故。

金丝桃苷等黄酮类化合物在抗炎、神经保护、特别是心脑血管疾病方面具有良好的应用潜力。本文优化得到的制备金丝桃苷的工艺，简单易行，条件温和，得率较高，且原料丰富。同时对深入研究金丝桃苷的生物活性及在临床和膳食方面的应用具有重要意义。

参考文献：

[1] 《中华本草》编委会.中华本草[M]. 上海：上海科学技术出版社, 1999: 782-785.

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[4] 王燕, 王先荣, 马凤余, 等. 金丝桃苷在植物中的分布及其含量测定[J]. 安徽医药, 2009, 13(11): 1312-1315.

[5] 汤建, 杨守士, 龚玺. 泽漆作为制备2''-O-没食子酰基金丝桃苷和金丝桃苷原料的应用及制备方法: 103012521A [P]. 2013-04-03.

[6] 马瑞丽, 李敏, 汤建, 等. 大孔吸附树脂制备尾叶香茶菜总二萜的工艺研究[J]. 中成药, 2014, 36(4): 848-851.

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[8] 李月梅, 种贝贝, 辛晓伟,等. 石韦中绿原酸的提取工艺优化及含量分析[J]. 中国野生植物资源, 2015(6): 37-39.