溃疡性结肠炎血小板中钾通道和NLRP3表达的临床意义

叶盛林，梅咏玉，韩 玮，杨 青，胡 翠，刘晓昌，梅 俏，许建明

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)中肠道炎症与止血机制密切相关[1]，可能与血小板的功能改变有关，血小板不仅参与止血过程，还可分泌炎症因子(如IL-1β)，参与炎症过程[2]。IBD患者的显著特征包括血小板功能活化，如GPIIb/IIIa、P-选择蛋白和CD40L表达增加，其中溃疡性结肠炎( ulcerative colitis, UC)患者血小板作为重要的炎症细胞也有明显的功能活化[3]。研究[2]显示血小板参与炎症反应需要IL-1β信号和NLRP3炎性小体活化，静息状态血小板可表达NLRP3、接头分子，在活化状态血小板中两者共定位组装成功能性NLRP3炎症小体，激活procaspase-1形成caspase-1，产生IL-1β等炎症因子，促进炎症过程。

NLRP3是核苷酸结合寡聚域样受体家族分子中的一种胞内型受体，与接头分子及效应分子(caspase-1)组装成NLRP3炎症小体。NLRP3炎症小体的激活需要NF-κB介导炎症小体前体表达上调，招募接头分子组装成特定结构，活化pro-caspase-1，产生炎症因子IL-1β和IL-18。在炎症性疾病(如自身免疫性疾病、感染、败血症)中均有NLRP3炎症小体的参与[4]。钾和钙是激活NLRP3炎症小体的关键介质[5]。Kv1.3通道是血小板的主要电压门控钾通道，Kv1.3通道促进活化血小板的早期钙离子内流，胞浆内钙离子浓度明显增加，Kv1.3通道可能通过增加激动剂诱发的Ca2+流入影响血小板活化[6]。血小板中存在中电导的钙激活的钾通道(Kca3.1)，可能与Kv1.3一起协同调节血小板内外钾和钙浓度，影响NLRP3炎症小体和血小板的活化过程[6-7]。因此，该研究通过检测活动期UC血小板Kca3.1、Kv1.3和NLRP3的表达情况，探讨溃疡性结肠炎血小板中NLRP3表达与钾通道的关系及其临床意义。

1 材料与方法

1.1病例资料收集安徽医科大学第一附属医院明确诊断的UC患者17例，年龄19～64(38.71±14.12)岁，采用改良Mayo评分标准进行疾病活动性评分，17例UC均为活动期，其中轻度3例，中度9例，重度5例。按2012年我国炎症性肠病诊断共识意见(广州)作为UC诊断标准[8]。正常对照组为经体检均合格及近3个月无胃肠道症状的11例健康志愿者，年龄24～55(35.00±9.86)岁，两组年龄差异无统计学意义。

1.2标本采集收集患者入院后(24 h内)次日晨的5 ml全血，立即低速离心(1 300 r/min，15 min)获取富血小板血浆(PRP)，取出PRP再次离心(3 000 r/min，20 min)去除血浆后，获取血小板于-80 ℃保存。

1.3RT-PCR方法检测血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的mRNA表达将血小板解冻，加入TRIzol(美国Invitrogen公司)匀浆裂解，再依次以氯仿、异丙醇、75℅乙醇(DEPC水配制)抽提，获取干燥RNA沉淀后，加入DEPC水溶解得总RNA。按逆转录试剂盒(美国Thermo公司)，总RNA被逆转录为cDNA 。GAPDH作为内参，按试剂盒说明书(德国Qiagen公司)的步骤进行加样扩增获取RT-PCR产物，引物序列和产物长度，反应条件均为97 ℃、5 min，93 ℃、30 s，52 ℃、30 s，70 ℃、40 s，36个循环；70 ℃、10 min，4 ℃、10 min。紫外凝胶成像系统分析各样本中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的表达情况。见表1。

表1 RT-PCR引物序列和产物长度

1.4Westernblot方法检测血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的蛋白表达取血小板解冻，裂解(RIPA细胞裂解液)后，离心取上清液，按照1 ∶4加入的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10 min后上样(每孔15 μl)，电泳，300 mA恒流转膜，完成后洗去转膜液加Western封闭液(5%脱脂奶粉)封闭2 h。参考一抗及二抗说明书，按照合适的比例滴加一抗稀释液(Kca3.1抗体属性为兔抗1 ∶200 稀释；Kv1.3抗体属性为鼠抗1 ∶500稀释；NLRP3抗体属性为兔抗1 ∶200稀释)，4 ℃缓慢摇动孵育过夜。加入洗涤液(PBST)洗涤3次，每次洗涤10 min，按照相应比例加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗稀释液。室温孵育2 h。加入洗涤液(PBST)洗涤8 h，洗涤3次。最后用ECL发光试剂盒(美国Thermo公司)进行蛋白检测。

2 结果

2.1UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3mRNA表达水平的改变与正常对照组相比，UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3 mRNA表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 RT-PCR法检测 Kca3.1、Kv1.3和NLRP3在正常和UC血小板中的表达

2.2UC患者血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3mRNA表达与疾病严重程度的关联分析轻、中、重度三组UC患者，Kca3.1 、Kv1.3、NLRP3 mRNA表达均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。组间比较差异均无统计学意义。见表2。

表2 不同严重程度UC血小板中Kca3.1、Kv1.3和NLRP3 mRNA的相对表达

2.3UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表达水平的改变与正常对照组比较，UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.4UC患者血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表达与疾病严重程度的关联分析轻、中、重度三组UC患者中血小板Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表达进行比较，差异无统计学意义；提示血小板Kca3.1、Kv1.3及NLRP3 蛋白表达水平与疾病的严重程度无明显相关性。

图2 Western blot法检测 Kca3.1、Kv1.3和NLRP3在正常和UC血小板中的表达

2.5UC患者血小板中NLRP3蛋白与Kca3.1、Kv1.3蛋白表达水平的相关分析相关分析显示，Kca3.1与NLRP3的蛋白表达水平明显相关，差异有统计学意义(r=0.877，P<0.01)(图3)；Kv1.3与NLRP3的蛋白表达水平有一定的相关趋势，差异无统计学意义。UC患者血小板Kca3.1、Kv1.3与NLRP3 蛋白表达水平分别与红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate ，ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein ，CRP)、Mayo评分进行相关性分析，均无明显相关性，差异无统计学意义(表3)。

图3 NLRP3和Kca3.1在蛋白质水平的相关性分析

3 讨论

UC以反复发作的慢性非特异性肠道炎症为特征，发病机制尚不十分清楚。研究[3-4]显示，血小板炎症反应参与了UC的病理生理过程，在小鼠DSS结肠炎模型中发现活化血小板数量明显增加[9]。血小板作为重要的炎症细胞在适应性免疫应答中具有关键作用，活化的血小板可以通过多种机制介导炎症和免疫应答，包括释放促炎、抗炎及血管生成因子，募集炎细胞到血管损伤和炎症部位[10]。研究[2]显示受登革热病毒感染患者体内血小板被激活及NLRP3-caspase-1炎症小体组装并介导血小板微粒中的IL-1β分泌，刺激血管内皮，导致通透性增加，加重渗出及炎症反应，IL-1β信号传导及NLRP3炎性小体活化参与血小板炎症过程。NLRP3基因与UC的易感性相关，可能在UC发病过程中起重要作用。研究[11]显示NLRP3炎症小体在DSS结肠炎模型结肠组织中高表达，槐耳提取液通过降低结NLRP3及IL-1β表达，改善结肠炎症。NLRP3是NLRP3炎症小体的关键组成部分，是NLRP3炎性小体激活的限速步骤[12]。因此，根据研究结果推测血小板中NLRP3的表达改变所致的炎症损伤可能与UC的发生过程有关。

表3 UC患者血小板蛋白质表达水平与ESR、CRP和Mayo评分的相关性分析

血小板中主要存在Kv和Kca两种类型钾通道，分别以Kv1.3和Kca3.1为主[6-7,13]。Mahaut-Smith[7]研究发现血小板存在Ca2+依赖性K+通道(Kca通道)。使用膜片钳技术证实血小板中存在高密度电压门控K+通道(Kv通道)和Kca通道[6-7]。研究[6,14]显示血小板Kv1.3通道与血小板活化有关，Kca3.1可能参与此过程，钾离子通过钾通道外流所致的细胞内低钾是导致NLRP3炎症小体活化重要条件，抑制钾离子外流可抑制NLRP3炎症小体的活化。相关研究[15]显示K+外排可能是所有NLRP3刺激致NLRP3激活所必需的共同特征。因此，UC中血小板Kv1.3、Kca3.1钾通道与NLRP3炎症小体的表达是否改变目前尚不清楚。

本研究显示， UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的mRNA和蛋白表达明显增高，提示血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的过表达可能参与UC的病理生理过程；而Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的表达水平与UC的严重程度以及CRP、ESR及Mayo评分等均无明显相关性，进一步提示以上三种物质的表达可能与病情严重程度及活动性无关。研究[3,6,14]显示，UC中血小板明显活化，血小板活化与钾通道和NLRP3炎症小体活化有关，推测UC血小板中Kca3.1、Kv1.3可能引起胞液内钾和钙离子浓度改变，进一步改变NLRP3活化过程，促进血小板活化，参与UC的炎症过程。另一方面，NLRP3与Kca3.1、Kv1.3蛋白表达水平有一定相关，提示UC血小板中NLRP3过表达与血小板中的钾通道增多可能有关。因此，推测由于感染等诱因，引起UC血小板中Kca3.1和Kv1.3钾通道明显增多及血小板内外钾钙离子浓度改变，促进NLRP3表达及NLRP3炎症小体活化，促进血小板活化，释放炎症因子，促进UC肠道炎症的发生，但UC血小板活化的具体机制仍需进一步研究。

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