高效液相色谱法测定人体外周血丙戊酸钠浓度
2018-04-20孙玉花叶延芬通讯作者袁会成赵良存
孙玉花 叶延芬(通讯作者) 袁会成 赵良存
(甘肃省武威肿瘤医院 甘肃 武威733000)
丙戊酸钠为广谱抗癫痫药,其抗痫谱广、疗效高,是较理想的抗癫痫药物。近年来,临床用于治疗偏头痛、原发性三叉神经痛、迟发性运动障碍等也有较好疗效[1-2],但其在临床上的治疗指数低,安全有效血药浓度范围较窄,而且服药周期长,容易发生不良反应[3]。患者长期服用丙戊酸钠治疗的过程中,密切注意影响丙戊酸钠血药浓度波动的因素,必须综合考虑各方面的因素,实行个体化给药,以血药浓度为依据,而确保患者的用药安全。本法通过优化血浆中丙戊酸钠提取方法,减少干扰因素,通过HPLC法测定肿瘤患者血浆中丙戊酸钠的含量,其专属性强、结果可靠,为临床使用丙戊酸钠做好药学监护提供了依据。
1.仪器与试药
LC100高效液相色谱仪(上海伍丰科学仪器有限公司);BSM电子天平(上海卓精电子科技有限公司),HX-03超声波清洗器(武汉恒信世纪科技有限公司)。
丙戊酸钠对照品由中国食品药品生物制品检定研究所提供(批号:100963-201302);乙腈为色谱纯;水为娃哈哈纯净水;正己烷、甲醇、三乙胺均为分析纯;空白血浆由血库供应。
2.试验方法
2.1 色谱条件
色谱柱:PronaosEP-C18柱(4.6mm×250mm);流动相:乙腈-水(75:25)[1],流速:1.0mL•min-1,柱温:35℃,检测波长:248nm;理论板数应不低于3000。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的丙戊酸钠对照品57.5mg,置于50mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得1.15mg•mL-1丙戊酸钠对照品溶液,4℃储存备用。
2.3 血清样品处理方法
精密吸取待测血清样品180μL于10mL试管中,加20μL甲醇,振摇混匀,加入1mol/L硫酸200μL,再加入正己烷5mL,旋涡振荡2min,取上清液至试管中,加入10g/L α-溴苯乙酮200μL,10%三乙胺50μL,超声2min,置55℃水浴中衍生化反应15min,挥干有机溶剂,残渣用乙腈200μL溶解,0.45μm滤膜滤过,取20μL进样。
2.4 对照样品处理
取健康人血清180μL于10mL小试管中,加入丙戊酸钠对照品溶液20μL,振摇混匀,加入1mol/L硫酸200μL,按照“2.3”项下处理,取20μL进样。
3.结果
3.1 色谱行为
空白血清、空白血清加丙戊酸钠对照品、待测血清样品色谱图见图1。由图可见在此色谱条件下丙戊酸钠的色谱峰能够完全分离,峰形对称,无杂质峰干扰,丙戊酸钠对照品的保留时间为12.86min,样品保留时间为12.76min。
3.2 线性关系考察
精密量取对照品贮备液1、2、4、6、8、10mL,分别加入10mL量瓶中,加流动相稀释制成0.115、0.230、0.46、0.69、0.92、1.15mg•mL-1对照品溶液,摇匀,分别精密量取20μL加入6只5mL具塞试管中,加健康人血清150μL。按照“2.3”项下处理,取20μL进样,以丙戊酸钠浓度(X)与丙戊酸钠峰面积(Y)进行线性回归得回归方程:Y=12.4235X-1.2536(r=0.9999)。结果表明:丙戊酸钠浓度(X)为11.5~115μg•mL-1间呈良好线性关系。
3.3 精密度考察
分别配制11.5、46、115μg/mL 3种浓度的对照品+血清各5份,置于5mL具塞试管中,按照“2.3”项下处理,分别于1d内连续检测5次及5d内每天检测1次,记录峰面积。计算日内和日间精密度,结果见表1。
表1 血清中丙戊酸钠的精密度(n=5,±s)
表1 血清中丙戊酸钠的精密度(n=5,±s)
样品中丙戊酸钠含量(µg/mL)日内精密度 日间精密度检测值(µg/mL)RSD(%) 检测值(µg/mL) RSD(%)11.511.44±0.0712.4211.38±0.142.71 46.045.86±0.841.0846.12±0.981.42 115.0115.5±0.680.61114.97±1.261.05
3.4 回收率考察
分别配制11.5、46、115µg/mL3种浓度的对照品血清样品各5份,按照“2.3”项下处理,测定色谱峰面积,计算回收率,结果见表2。
表2 回收率试验结果(n=5,±s)
表2 回收率试验结果(n=5,±s)
加入丙戊酸钠对照品量(µg/mL) 检出量(µg/mL) 相对回收率(%)RSD(%)11.511.55±0.1698.262.62 4645.68±0.8599.351.12 115113.68±1.2199.471.34
3.5 稳定性考察
取丙戊酸钠贮备液,用流动相分别配制成11.5、46、115µg/mL3种浓度的对照品血清样品溶液,于4℃冰箱保存,分别在0、1、3、5d进样,记录峰面积,三种不同浓度丙戊酸钠的照片峰面积的RSD分别为1.05%、1.84%、2.21%,n=4。表明丙戊酸钠对照品溶液在5天内稳定。
4.讨论
4.1 丙戊酸钠为一种不含氮有机酸盐,有效血药浓度为50~100μg/mL,血药浓度超过100μg/mL,毒副作用增加疗效无明显增加[4],主要引起血清碱性磷酸酶和氨基转移酶升高,倦睡、眩晕、疲乏、头痛、共济失调、轻微震颤、异常兴奋、不安和烦躁等反应[5],因此在用药过程中检查血药浓度来为临床治疗提供依据。
4.2 目前,有关丙戊酸钠在人体血浆中浓度检测方法主要采用荧光偏振免疫分析法(FPIA),其精密度与准确度均较高,在临床抗癫痫治疗中,可有效的指导临床合理用药,但FPIA法仪器设备昂贵,各医疗机构FPIA不能普遍使用,部分欠发达地区的用药人群不能提供药学监护,本文丙戊酸钠药物浓度测定方法为有关资料[6-7]报道的高效液相色谱法,用α-溴苯乙酮柱前衍生化反应,丙戊酸钠的保留时间和分离效果比较理想。
4.3 丙戊酸钠经柱前衍生化后与血浆中其他成分分离效果好,其他成分对测定无干扰,有文献报道[8],HPLC法检测结果略高于FPIA法,我们采用HPLC法和FPIA法进行检测比较,两种方法无显著差异,本文HPLC法样品处理步骤简便、方法简单、重复性好、结果准确,适用于丙戊酸钠的血药浓度测定及临床药代动力学研究。
【参考文献】
[1]陈新悦.丙戊酸钠的临床新用途[J].中国农业,2006,15(10):62.
[2]刘智.丙戊酸钠治疗精神病患者的攻击行为[J].重庆医学,2007,36:490-491.
[3]朱斌.1214例丙戊酸血药浓度监测的回顾性分析[J].药物流行病学杂志,2008,17:48-49.
[4]王宏虹.丙戊酸钠血药浓度监测研究概况[J].齐鲁药事,2012,31:10.
[5]何思陆.丙戊酸钠致不良反应39例文献分析[J].中国药房,2010,21:40.
[6]陈艳,袁君.柱前衍生HPLC法测定丙戊酸钠的血药浓度及其临床应用[J].安徽医药,2010,14:289-290.
[7]冯惠平,陈宜峰.柱前衍生-高效液相色谱法测定人血清中丙戊酸钠的浓度[J].中国药师,2009,12:1755-1757.
[8]张浩,李金德.FPIA法与HPLC法监测癫痫患儿外周血丙戊酸钠浓度差异的比较[J].中国生化药物杂志,2017,1:37.