核酸适体传感法检测中药材中黄曲霉毒素B1

2018-04-19曾云龙程圆昕易守军唐春然

发光学报 2018年4期

曾云龙，程圆昕，易守军，张敏，何盼，赵敏，唐春然

(1. 湖南科技大学化学化工学院理论有机和功能分子教育部重点实验室，湖南湘潭 411201；2. 湖南科技大学材料科学与工程学院，湖南湘潭 411201)

1 引言

中药是中国医药学的瑰宝，是中医治疗疾病的物质基础，对人类的文明和进步做出了伟大贡献。世界卫生组织调查显示：世界范围内约70%～80%的人口在一级疾病治疗中使用过传统药物，其中主要是中草药[1]。由于西药显示出各种副作用，以及中药对疾病尤其是重大疾病如癌症以及重度烧烫伤等均能显示出高的疗效，欧美等发达国家开始使用植物药，从而引发植物药中药材在国际市场的持续升温。真菌毒素是某些真菌的代谢物，具有强毒性，尤其是黄曲霉毒素。黄曲霉毒素对中药材污染很普遍[2-5]，但中药材中微量黄曲霉毒素一般不表现出急性毒性，然而它们在人体内有较强的蓄积性，具有致癌、致畸、致突变、肝毒性等。黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前已知最强的化学致癌物，其潜在危害巨大，严重影响中药的安全性。为了保证药用安全，中药材中AFB1为必检项目。欧州药典规定草药中AFB1限量为2 μg/kg，韩国药典规定为10 μg/kg，中国药典为5 μg/kg。

目前，黄曲霉毒素检测方法主要有色谱法和酶联免疫法等[6-9]。酶联免疫法灵敏、选择性高，但所用抗原/抗体和酶的价格高，且易失活而失效；薄层色谱扫描法存在不够灵敏、重现性低、操作繁琐以及有机溶剂耗量大的缺点；色谱法及色-质联用法技术要求高、所需试剂纯度高、仪器设备昂贵、分析成本高，不易普及。因此，非常有必要发展简单、快速、灵敏、准确的中药材黄曲霉毒素检测方法。核酸适体具有特异性高、稳定、价格低的显著优势。近年来，基于核酸适体的生物传感法[10-11]广泛用于环境监测、疾病诊断和食品中毒物残留分析，然而，用于检测中药(材)中痕量真菌毒素残留的报道较少。CdTe量子点优异的光学特性使其广泛应用于化学生物传感[12-14]。本文拟利用核酸适体对黄曲霉毒素B1呈现的高特异性，以CdTe量子点为荧光探针，建立几种中药材中黄曲霉毒素B1的简单、快速、灵敏的核酸适体传感检测新方法。

2 实验

2.1 主要试剂与仪器

巯基修饰的AFB1核酸适体(Apt)：HS-5′-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCT-CGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′[11]由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、伏马毒素B1(FB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)(北京华安麦科生物技术有限公司)，氯化镉、硼氢化钠、半胱胺盐酸盐、氯金酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、TeO2等均为分析纯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其他试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司)；TG16B台式高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；KQ-50DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；78-1磁力加热搅拌器(金坛市双捷实验仪器厂)。

2.2 实验方法

2.2.1 CdTe量子点的制备

CdTe量子点的制备参照文献[15]方法并稍做改进。取1.92 mmol CdCl2和5.76 mmol半胱胺盐酸盐置于250 mL圆底烧瓶中，在磁力搅拌下用160 mL二次蒸馏水溶解，调节pH=6.0，得到Cd前体溶液；再取0.96 mmol二氧化碲于20 mL二次水中，并向其中加入7.68 mmol的硼氢化钠，磁力搅拌下置于60 ℃的水浴中避光反应1 h，得紫色透明的Te前体溶液；将刚制备的Te前体溶液加入到Cd前体溶液中并在室温下搅拌反应2 h，然后迅速转移至100 ℃水浴中回流反应3 h，得到192 mL红色透明的半胱胺(巯基乙胺)修饰的CdTe量子点(CdTe QDs)。CdTe QDs的浓度为5 mmol/L(按Te量计)，避光保存。临用时，先对CdTe QDs纯化。以乙醇将CdTe QDs沉降，离心分离，弃去离心液；沉淀用50%乙醇溶液洗涤，离心分离，弃去离心液，如此处理3次后，超声分散到二次水中即得到纯化的巯基乙胺修饰的CdTe QDs，避光保存，备用。

2.2.2 金纳米粒子的制备

金纳米粒子按文献[16]方法以柠檬酸钠还原氯金酸制备。取250 mL 0.1 mmol HAuCl4溶液置于洁净的烧杯中，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入5 mL 38.8 mmol 柠檬酸钠，溶液颜色由浅黄变为酒红色，继续反应30 min后冷却至室温。AuNPs 的浓度按文献[17]方法测定为2.7 nmol/L。

2.2.3 金纳米粒子表面修饰核酸适体

依据文献[18]方法，以巯基修饰的核酸适体对金纳米粒子进行表面修饰。先将巯基AFB1核酸适体用 10 mmol/L TCEP(Apt∶TCEP=1∶5) 活化1 h，然后将活化的Apt与2.6 nmol/L AuNPs 混合，再加入500 mmol/L pH 3.0 酒石酸-HCl 缓冲溶液，在室温下轻摇孵化30 min，转至10 000 r/min离心25 min除去未修饰到金纳米粒子表面的Apt，再用pH 为7.0的10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗，如此3次，得到Apt修饰的金纳米粒子(AuNPs/ Apt)，将其分散至水中，4 ℃下储存备用。

2.2.4 AFB1分析程序

巯基乙胺修饰的CdTe QDs 2 mmol/mL 与AuNPs/Apt在10 mmol/L PBS(pH 7.2)溶液中混合反应10 min,离心除去过量的CdTe量子点，得到AuNPs/Apt/CdTe QDs复合物。测定体系荧光强度；然后，向AuNPs/Apt/CdTe QDs复合物体系中加入不同浓度的AFB1(0～2.0 ng/mL)，混匀，测定体系的荧光光谱。并按同样的方法，向AuNPs/Apt/CdTe QDs复合物中加入其他真菌毒素(AFB2、FB1、OTA、ZEN和DON)，进行传感器的选择性实验，AFB1的浓度为1.0 ng/mL，其他真菌毒素的浓度均为10 ng/mL，以460 nm为激发波长，测定荧光发射光谱(最大发射波长为575 nm)。所有的光谱测定都在室温下10 mmol/L 磷酸二氢钠-磷酸氢二钾(PBS，pH7.2)缓冲溶液中进行。所得数据均为三次测定平均值。

2.2.5 中药材中AFB1分析

取中药材样品研碎粉末5 g(过3号筛),准确称定,准确加70%甲醇溶液50 mL,超声处理 30 min,离心5 min(离心速度4 000 r/min),准确吸取上清液10 mL,用水稀释至20 mL,摇匀,即得供试品溶液。

取供试品溶液适量置于AuNPs/Apt/CdTe QDs复合物分散体系中，混匀，再加入PBS缓冲溶液，摇匀，孵化10 min，测定体系的荧光光谱，确定中药材中AFB1含量。

用RF-5301PC型荧光分光光度计测荧光强度(F)。同时做AFB1试剂空白(F0)。测定时激发波长选用460 nm，激发和发射狭缝都设置为5.0 nm。

3 结果与讨论

3.1 方法原理

金纳米粒子具有强烈的荧光猝灭功能[19]。在本工作中，我们选用CdTe量子点作为荧光探针，金纳米粒子为荧光猝灭剂。先将带负电荷的巯基-AFB1核酸适体修饰金纳米粒子表面形成AuNPs/Apt；带正电荷的CdTe QDs通过静电作用在AuNPs/Apt表面自组装形成AuNPs/APt/CdTe QDs复合物，并使CdTe QDs荧光猝灭。向体系中加入AFB1时，Apt选择性地与AFB1作用，并释放出CdTe QDs，体系荧光恢复。图1表明，加入的AFB1量越大，释放出的CdTe QDs就越多，体系荧光强度就越大，依据荧光强度与AFB1的量的关系，可以建立一种基于CdTe量子点荧光恢复的核酸适体荧光传感检测AFB1的新方法。

图1 金纳米粒子/核酸适体/CdTe量子点+黄曲霉素B1体系的荧光光谱

Fig.1 Fluorescence spectra of AuNPs/aptamer/CdTeQDs+AFB1

3.2 核酸适体用量的影响

在Apt∶AuNPs的摩尔浓度比为50∶1～300∶1范围，制备AuNP/Apt复合物，然后向AuNPs/Apt复合物体系中加入过量的CdTe QDs，离心分离除去未自组装的CdTe DQs，再将AuNPs/Apt/CdTe QDs分散至二次水中，测其荧光发射光谱曲线。结果见图2。从图2可知，Apt∶AuNPs在175∶1～225∶1范围，体系荧光均能有效猝灭，而225∶1时猝灭程度最大。

图2 核酸适体与金纳米粒子的量比对体系荧光猝灭的影响

Fig.2 Influence of aptamer and AuNPs molar ratio on fluorescent quenched

考察Apt修饰量对CdTe QDs的猝灭后，体系中加入AFB1的荧光恢复情况。在Apt∶AuNPs为175∶1、200∶1和225∶1复合物体系中，CdTe QDs荧光恢复分别为75.9%、79.3%和81.6%。因此，Apt∶AuNPs为225∶1有更为有效的荧光猝灭和荧光恢复。所以在后续实验中选择Apt的用量为AuNPs的225倍，依此确定AuNPs/Apt/CdTe QDs之比为1∶225∶900(量比，CdTe QDs浓度以Te量计算)。

3.3 pH及盐的浓度的影响

在pH 4.0～9.0范围，研究了pH对体系荧光恢复的影响。在pH 4.0～7.0时，体系荧光随pH升高而显著增强；pH 7.0～7.5范围，体系荧光缓慢增强，且在pH 7.5时达到最大值；之后随pH值的增大而逐渐降低，当达到pH 9.0时体系荧光强度显著下降。故在后续实验中，控制体系pH 值为7.2。

体系荧光强度随pH值的改变而变化的现象主要是CdTe QDs对H+离子敏感。在酸性条件下，量子点表面氨基接受质子，引起荧光猝灭，随pH值的升高，氨基接受的质子明显减少，荧光强度显著提高；在碱性条件下，由于量子点表面的氨基存在，彼此间可以形成氢键，从而引发团聚现象，使荧光猝灭，体系的荧光强度显著降低。

考察了NaCl对体系荧光的影响。实验表明，NaCl 浓度在50 mmol/L时，对体系荧光无明显影响。

3.4 孵化时间的影响

在室温下，考察了孵化时间对荧光恢复的影响。实验结果显示，孵化时间达到5 min时，体系荧光迅速恢复并在1 h内荧光强度无明显变化，继续延长孵化时间，体系荧光强度不再变化。故确定孵化时间为5 min。

孵化实验表明，溶液中AFB1迅速与纳米复合物中的Apt结合并释放出CdTe QDs，使体系荧光强度迅速恢复并达到平衡，为样品中AFB1的快速检测提供了保证。

3.5 其他真菌毒素物的影响

控制AFB1浓度为1.0 ng/mL，其他真菌毒素的浓度为10 ng/mL，进行了方法的选择性实验，结果见图3。从图3可知，AFB1核酸适体对AFB1呈现高选择性，其他真菌毒素无明显干扰。

图3 核酸适体传感分析的选择性，AFB1为1.0 ng/mL，其余真菌毒素浓度为10 ng/mL。

Fig.3 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of AFB1: 1.0 ng/mL, others: 10.0 ng/mL.

3.6 标准曲线和检出限

在10 mmol/L PBS(pH=7.2)纳米复合物(AuNPs/Apt/CdTe QDs比为1∶225∶900)分散液中，分别依次加入不同浓度的AFB1标准溶液，孵化5 min，测定体系荧光光谱，结果见图4。从图4可知，随着AFB1的浓度增大，体系荧光强度也随之增强，但最大荧光发射波长不变；进一步研究表明，体系的荧光恢复程度y(y=F-F0)与AFB1浓度在0.005 ～ 2.0 ng/mL范围内呈现出良好的线性关系(图4)，其线性回归方程为y=27.71+274.2C(C为AFB1的浓度，单位：ng/mL)，相关系数为0.997 1，方法检出限(3σ/k)为1.2 pg/mL。

图4 体系的荧光强度随AFB1浓度(0,0.005,0.010,0.020,0.040,0.060,0.080,0.10,0.20,0.40,0.75,1.00,1.50，2.00 ng/mL)的变化情况。插图：F-F0与AFB1的浓度在0.005～2.0 ng/mL范围内成良好的线性关系。

Fig.4 Dependence of FL intensity on the concentration of AFB1(0, 0.005, 0.010, 0.020, 0.040, 0.060, 0.080, 0.10, 0.20, 0.40, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 ng/mL). Inset shows the linear relationship betweenF-F0and AFB1 concentration within the range of 0.005-2.0 ng/mL.

3.7 分析应用

将所构建的核酸适体传感体系应用于连翘、甘草和山楂等中药材中的 AFB1 检测，结果如表1所示。

表13种中药材样品中AFB1的检测

Tab.1 Detection of AFB1 in three kind of Chinese traditional medicines (n=3)

中药材样品测定量/(μg·kg-1)加入量/(μg·kg-1)回收率/%相对标准差/%连翘10．00550．005105．53．5连翘20．00120．001104．23．2山楂10．861．0102．82．8山楂20．630．597．64．9山楂32．55．0103．22．5甘草113．515．0101．51．6甘草25．85．0102．82．4甘草311．410．0102．52．2甘草42．65．097．33．3

从表1 可知，甘草污染严重，山楂也有一定的污染，连翘仅是轻微污染。另外，回收率和 RSD 的结果表明，该传感体系适用于中药材中残留黄曲霉毒素B1的检测。

4 结论

以黄曲霉毒素B1核酸适体、金纳米粒子和CdTe量子点制备了AuNPs/Apt/CdTeQDs核酸适体复合物；金纳米粒子使复合物中量子点荧光猝灭，而黄曲霉毒素B1与复合物中核酸适体高选择性地结合并释放出量子点，使其荧光恢复，据此，建立了一种高选择性、高灵敏测定黄曲霉毒素B1的传感分析方法。该方法在实际样品分析中的回收率在97.3%～105.5%，相对标准差小于5%，能满足中药材中痕量黄曲霉毒素B1的检测要求。

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