紫癜灵对慢性免疫性血小板减少症患者Trp代谢的影响

高云龙，卓兰云，陈瑶，陈秋杰，马艳，黄宪章，吴新忠

1.广东省中医院，广东 广州 510120；2.广州市海珠区疾病预防控制中心，广东 广州 510288

免疫性血小板减少症(ITP)原指不明原因的获得性机体功能紊乱，使外周血血小板计数减少，皮下黏膜出血的一种临床出血性疾病。近年来，越来越多的研究证明ITP的发病是由于机体自身免疫功能紊乱，异常活化的T淋巴细胞刺激B淋巴细胞产生针对自身血小板的抗体，使患者体内血小板数量减少[1～2]。色氨酸(Trp)是T淋巴细胞增殖的必需氨基酸，Trp浓度减低会阻止T淋巴细胞的增殖。吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)是Trp沿犬尿氨酸(Kyn)途径进行分解代谢的关键酶和限速酶[3]，色氨酰-tRNA合成酶(TTS)能使Trp形成色氨酰-tRNA复合物，构成蛋白质合成的Trp库，可拮抗IDO对T淋巴细胞增殖的抑制。有研究显示，约20%的慢性ITP患者对激素治疗不敏感，并且在脾切除后可复发[4]。紫癜灵具有滋阴凉血的功效，临床上常用于治疗病程缠绵、反复出血的慢性ITP阴虚血热证患者。本研究观察治疗前后患者T淋巴细胞IDO和TTS表达及血浆Trp、Kyn浓度的变化，从IDO/TTS介导的Trp代谢途径探讨紫癜灵治疗ITP的作用机制。

1 临床资料

选取2014年9月—2015年12月在广东省中医院就诊的20例慢性ITP阴虚血热证患者，其中男8例，女12例；年龄13～61岁，平均(31.42±11.37)岁；血小板计数(2～36)×109/L，平均(14.56±11.63)×109/L。符合《血液病诊断及疗效标准》[5]中ITP的诊断标准；符合阴虚血热证的辨证标准：皮肤出现瘀斑，斑色鲜红或紫暗，五心烦热，口干，潮热盗汗，头晕目眩，舌红、少苔或无苔，脉细数。排除糖尿病、高血压病、消化道溃疡、结核、肝炎等慢性疾病及其他自身免疫性疾病；采样之前至少两星期未使用免疫抑制剂或糖皮质激素进行治疗。

2 治疗方法

患者组采用紫癜灵(药物组成：熟地黄、龟板、水牛角、茜草、槐花各20 g，生地黄15 g，白芍、黄精、旱莲草、女贞子、牡丹皮、连翘、贯众、玄参各12 g，砂仁3 g)治疗。每天1剂，水煎取汁300 mL，分2次口服。30天为1疗程，治疗2疗程。治疗期间不给予其他药物治疗。选取健康志愿者20例作为正常对照组，不做任何处理。

3 观察指标与统计学方法

3.1 观察指标 ①CD4+、CD8+T淋巴细胞的IDO和TTS表达：抽取ITP患者治疗前后及健康志愿者外周血各10 mL，分离外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC浓度调整至 5×105个 /mL。每一试管加入CD4+、CD8+抗体各 5 μL，4℃避光静置 30 min。PBS洗涤1次，漩涡振荡条件下加入500 μL固定剂，室温静置10 min。PBS洗涤1次，加入200 μL破膜剂重悬细胞，1 500 rpm离心15～20 min。除阴性对照管外，每管加入IDO抗体4 μL，1∶50稀释的TTS抗体5 μL，室温避光静置30 min，再加入破膜剂洗涤1次。200 μLPBS将细胞悬起，加入羊抗兔IgG TTS抗体5 μL，4℃避光静置30 min。PBS洗涤2次，用400 μL PBS重悬细胞，使用BD CantoⅡ流式细胞仪检测，FACS Diva 7.0软件分析流式的检测结果，用CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO和TTS荧光表达强度来评估IDO与TTS的表达水平。淋巴细胞分离液购自德国Fresenius Kabi公司；CD8-PerCP/Cy5.5、CD4-PECY7购自美国Biolegend公司；TTS-抗体购自ePitomics公司；羊抗兔IgG TTS-APC二抗、兔抗人IDO抗体、固定剂、破膜剂购自美国R&D公司。②液相色谱-质谱联用分析系统(LC-MS/MS)检测IDO酶的活性：取100 μL的血浆样品加200 μL乙腈，漩涡振荡1 min，静置30 min后14 000 g高速离心30 min，取上清液 10 μL加入色谱柱(Thermo Syncronis-C18)中进行分析。流动相：A相乙腈与水体积比为5∶95(含0.1%甲酸)，B相乙腈与水体积比为95∶5(含0.1%甲酸)，流速为0.2 mL/min。采用外标法，以Trp和Kyn标准溶液制备的标准曲线进行测定。L-Trp、L-Kyn购自美国Sigma公司。

3.2 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件处理数据。计量资料以(±s)表示，正常对照组和患者组治疗前的数据采用独立样本t检验，患者组治疗前后的数据采用配对样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 疗效标准与治疗结果

4.1 疗效标准 参照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2012年版)》[6]拟定。完全反应：100×109/L≤治疗后血小板计数，临床无出血；有效：30×109/L＜治疗后血小板计数＜100×109/L，且至少比基础血小板数增加2倍，临床无出血；无效：治疗后血小板计数＜30×109/L或临床有出血。确定完全反应和有效时至少检测2次，间隔至少7天。

4.2 紫癜灵的治疗效果 完全反应10例，有效7例，无效3例，有效率85.0%。

4.3 2组CD4+、CD8+T淋巴细胞IDO与TTS的荧光表达强度比较 见表1。患者组治疗前CD4+、CD8+T淋巴细胞IDO的平均荧光强度低于正常对照组(P＜0.05)，TTS的平均荧光强度高于正常对照组(P＜0.05)。治疗后，患者组CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO的平均荧光强度较治疗前上升(P＜0.05)，TTS的平均荧光强度较治疗前下降(P＜0.05)。

表1 2组CD4+、CD8+T淋巴细胞IDO与TTS的荧光表达强度比较(±s，n=20)

表1 2组CD4+、CD8+T淋巴细胞IDO与TTS的荧光表达强度比较(±s，n=20)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与患者组治疗前比较，②P＜0.05

组 别C D 4+T淋巴细胞 C D 8+T淋巴细胞正常对照组患者组治疗前患者组治疗后I D O 5 5 4.3 6±5 1.1 2 1 8 8.1 0±2 7.1 6①8 5 6.8 5±3 0 9.0 4②T T S 1 7 6 8.7 3±8 9.1 5 4 6 5 8.9 7±1 8 3.8 5①1 7 0 9.6 5±1 1 8 1.3 5②I D O 3 2 5.0 4±6 1.3 9 1 6 1.5 8±2 0.8 7①7 5 4.5 2±2 6 9.4 7②T T S 1 5 1 2.3 1±1 0 5.1 0 5 6 2 6.2 8±4 0 5.4 6①2 3 1 1.6 3±1 2 6 1.2 9②

4.4 2组血浆Trp、Kyn浓度比较 见表2。患者组治疗前血浆Trp及Kyn浓度均高于正常对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。治疗后，患者组Trp浓度较治疗前降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；Kyn浓度较治疗前升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 2组血浆Trp、Kyn浓度比较(±s) μmol/L

表2 2组血浆Trp、Kyn浓度比较(±s) μmol/L

组 别正常对照组患者组治疗前患者组治疗后n 2 0 2 0 2 0 T r p 5.9 4 8±2.9 3 0 9.6 8 0±3.4 0 3①4.8 9 6±1.8 8 5②K y n 0.1 0 4±0.0 4 2 0.1 5 0±0.0 5 2①0.1 9 1±0.0 4 0②

与正常对照组比较，①P＜0.05；与患者组治疗前比较，②P＜0.05

5 讨论

ITP是由于机体自身免疫功能紊乱，异常活化的T淋巴细胞刺激B淋巴细胞产生针对自身血小板的抗体，使血小板的生成减少或破坏增加，临床表现为因血小板数量减少而诱发的出血性疾病。近年来，较多研究证明自身反应性CD4+T淋巴细胞为触发和维持病理性抗血小板自身抗体免疫应答的关键[7～8]。同时，CD8+T淋巴细胞也可通过T淋巴细胞介导的细胞毒性作用参与ITP的发病。

中医学认为，ITP归属于血证范畴，《血证论》中提出治血主要为宁血、止血、补血和消瘀四大治法。慢性ITP临床多表现为虚实夹杂，病机以阴虚血热为主，主要以为滋阴凉血为治法。紫癜灵具有清热凉血、化瘀生新、宁络止血的功效，同时可补益肝肾、养阴填精、清热解毒泻火。方中熟地黄、龟板、白芍、黄精、早莲草、女贞子补益肝肾、养阴填精，以顾肝肾本虚；水牛角、生地黄、牡丹皮、茜草、槐花清热降火凉血，兼以化瘀生新、宁络止血；连翘、贯众、玄参清热解毒泻火，以祛火毒之实；砂仁理气和胃，使补药不壅滞，苦药不伤胃。现代医学研究表明，紫癜灵组方中连翘、茜草、牡丹皮等能增强毛细血管的致密性，保持毛细血管的正常抵抗力，缩短出血及凝血时间[9]。程宗琦等[10]通过动物实验证明了紫癜灵具有抑制单核巨噬细胞的吞噬功能，同时能显著缩短出血时间，临床上对于皮肤紫癜等疾病的渗出性出血具有很好的缓解作用。

Trp是T淋巴细胞活化与增殖的必需氨基酸，通过IDO与TTS调节Trp的分解代谢，参与调控机体免疫应答。实验结果显示，ITP患者的CD4+、CD8+T淋巴细胞中IDO的表达量明显低于正常对照组，而患者CD4+、CD8+T淋巴细胞中TTS的表达量却明显高于正常对照组。有研究表明，TTS表达上调和IDO介导的Trp代谢异常共同参与细胞免疫调节，活化的T细胞可以利用氨基酸的能力增强，TTS表达上调以增加细胞内色氨酰-tRNA的储备，同时通过竞争抑制机制，减少IDO介导的Trp降解[11]。治疗前患者血浆中Trp和Kyn浓度较正常对照组高，表明体内Trp仍可通过IDO途径代谢，IDO在体内不断消耗，Kyn的浓度相应升高；但Trp浓度未出现降低，可能与TTS的高表达储备氨基酸能力增强有关。

服用中药紫癜灵合剂后，治疗有效组患者的IDO在CD4+、CD8+T淋巴细胞的表达明显升高，而TTS的表达则下降。Trp浓度下降，Kyn浓度上升。说明紫癜灵的治疗使TTS表达下降，减少色氨酸-tRNA复合物的贮存量。IDO的活性增高使其更好的发挥免疫抑制作用，T淋巴细胞的增殖受到抑制，导致自身反应性T淋巴细胞的活化减弱，减少了对自身血小板的破坏。此结果表明，在ITP患者体内，IDO的免疫抑制作用并没有减弱，是由于TTS加载的色氨酸-tRNA蛋白复合物增加了IDO酶的消耗，无法正常发挥其应有的免疫调节作用。治疗无效的患者TTS表达未见明显减低，可能与患者体内存在保护TTS酶活性的物质或拮抗紫癜灵药物活性的成分有关，无法抑制T淋巴细胞增殖，使得新生血小板继续破坏。

本研究通过检测慢性ITP患者体内的IDO/TTS介导Trp代谢过程中各项指标的变化，发现紫癜灵可能是通过降低慢性ITP阴虚血热证患者体内的TTS表达，减弱了TTS对IDO的拮抗作用，使患者已受损的免疫抑制功能得到一定程度的恢复和改善。患者的临床症状有所好转甚至完全缓解，为紫癜灵治疗慢性ITP患者的机制研究提供参考。

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