餐饮食品中罂粟壳的快速测定方法

2018-04-19丁建兰黄恩堂

现代食品 2018年24期

◎ 黄宁，丁建兰，黄恩堂，杨希

（鹰潭市综合检验检测中心，江西鹰潭 335000）

近年来，人们越来越关注食品中非法添加药物的问题。党的十九大报告明确指出“实施食品安全战略，让人民吃得放心”。中央已经把食品安全提高到战略高度，但在食品中非法添加罂粟壳来吸引顾客的行为，仍屡禁不止。长期食用含罂粟壳的食品会对人的神经系统、消化系统、内分泌系统造成危害。为了维护广大人民群众的身体健康，要严厉打击非法添加现象，建立快速、准确的餐饮食品中罂粟壳的测定方法具有重要意义。

餐饮食品中罂粟壳的检测方法于2018 年之前尚无国家标准，2018 年4 月市场监管总局发布的《食品中罂粟碱、吗啡、可待因、那可丁和蒂巴因的测定液相色谱-串联质谱法》补充了检验方法，由于设备资源有限，基层推广时无法直接照搬使用，给我国餐饮食品的监督管理工作带来了一定的技术难题，为进一步保障人民的饮食安全，维护人民身体健康，研究餐饮食品中罂粟壳的检测方法势在必行。笔者参考了大量文献[1-67]，在相关研究的基础上，建立了一种经济、快速、准确且灵敏度高的餐饮食品中罂粟壳的检测方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

液相色谱/质谱联用仪（三重串联四级杆质谱）LC/MS QQQ（配四元泵、柱温箱、自动进样器、电喷雾离子源ESI，美国Agilent Technologies 1290 Inf inity Ⅱ/6460 Triple Quad LC/MS）；电子天平（赛多利斯科学仪器上海有限公司MSA225P-CE）。

1.2 材料

盐酸、乙醇、正丁醇、三氯甲烷、浓氨、碘化铋钾试液、碘化汞钾试液、甲醛硫酸试液、钼硫酸试液、稀铁氰化钾试液、氢氧化钠、乙酸乙酯、甲酸、丙酮、氨水、苯、甲苯及亚硝酸钠乙醇试液为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。过滤用0.22 μm 滤膜。其他材料及其来源见表1 和表2。

表1 罂粟壳药材来源表

表2 标准品来源表

待测样品为市场上的牛肉粉面、烤肉串、酱卤鸡腿、火锅底料、自制酱料及麻辣烫6 类食品共25 批样品。

2 试验条件的选择

2.1 理化反应试剂的选择

根据生物碱特性，分别用碘化铋钾试液、碘化汞钾试液、甲醛硫酸试液、钼硫酸试液和稀铁氰化钾试液与样品反应，结果显示（图1）加碘化铋钾试液（管1、3）、碘化汞钾试液（管2、4）反应效果好，阳性对照与阴性对照结果区别很明显。

图1 化学鉴别反应结果图

2.2 薄层色谱条件的选择

2.2.1 薄层板的选择

分别用硅胶G 薄层板、硅胶GF254薄层板、2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板试验。

2.2.2 展开剂的选择

分别用乙酸乙酯-甲酸-氨水（13 ∶2 ∶1）、三氯甲烷-丙酮-氨水（16 ∶4 ∶0.3）、三氯甲烷-甲醇-氨水（13 ∶2 ∶0.3）、丙酮-苯-乙醇-氨水（20 ∶20 ∶5 ∶2）、乙酸乙酯-甲醇-氨水（85 ∶5 ∶2）以及甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液（20 ∶20 ∶3 ∶1）作为展开剂进行试验。

2.2.3 显色剂的选择

分别用碘化铋钾试液、亚硝酸钠乙醇试液、改良碘化铋钾试液喷在展开后的薄层板上。

2.2.4 检视条件的选择

分别在日光下、紫外光灯254 nm 下、紫外光灯365 nm 下检视。

2.2.5 结果

检视结果如图2 ～4 所示。

图2 喷显色剂碘化铋钾试液后日光下检视图

图3 紫外光灯365 nm 下检视图

图4 喷显色剂亚硝酸钠乙醇试液后日光下检视图

如图3 所示，薄层板用硅胶G 板较好，选择“丙酮-苯-乙醇-氨水（20 ∶20 ∶5 ∶2）”作为展开剂，5 种生物碱分离效果好，生物碱对照品点1 ～5 分离较好。显色剂选择碘化铋钾试液较理想，目标物质斑点显色清晰，呈橙红色，薄层板背景呈淡黄色，颜色均匀。如图3 中点5 所示，喷显色剂亚硝酸钠乙醇试液后，目标物质的斑点明显变成鲜艳的橘红色，斑点颜色明显，但界限不清晰，而且薄层板背景由深红棕色慢慢转白，颜色不均匀。

检视在日光下较好，如图2 所示。在紫外光365 nm下检视很不理想，目标物质没有荧光斑点，检视不出来，如图4 中点1 ～5 所示；样品中的其他杂质荧光斑点清晰，如图4 中点7 所示。

2.3 流动相的选择

试验尝试多种流动相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵溶液、乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾+0.02 mol·L-1磷酸氢二钠氢溶液、乙腈-0.01mol·L-1乙酸铵溶液（pH3.0、3.5、3.8、4.0、4.3），试验表明乙腈-0.01 mol·L-1乙酸铵溶液（pH4.3）梯度洗脱分离效果最好，如图5 所示。

2.4 柱温的选择

分别在30、35、40 ℃柱温下进行试验，结果在柱温40 ℃时峰分离度和峰型最好，如图5 所示。

图5 40 ℃柱温时峰分离度图

3 方法与结果

3.1 理化反应法

3.1.1 方法

取样品5 g，加5%盐酸乙醇溶液20 mL，超声 30 min，趁热滤过，滤液蒸至近干，残渣中加5%盐酸溶液5 mL 使之溶解，分置二支试管中，一管中加碘化铋钾试液，生成橙红色沉淀；另一管中加碘化汞钾试液，生成灰白色沉淀。

3.1.2 结果判断

供试品应不呈正反应，若两管均呈正反应，则结果疑似阳性，待液-质联用法确证。

3.2 薄层色谱法

3.2.1 实验方法

（1）对照品溶液的制备。分别取吗啡、那可汀、可待因、蒂巴因及罂粟碱对照品，用甲醇分别稀释至0.2、0.2、0.4、0.8 mg·mL-1与0.4 mg·mL-1的溶液，即得单个对照品溶液。将5 种对照品溶于同一容量瓶中，得混合对照品溶液。

（2）样品溶液的制备。取样品10 g，加甲醇30 mL 加热回流30 min，趁热滤过，滤液蒸至近干，残渣加甲醇1 mL 溶解。

（3）薄层板。硅胶G 板。

（4）展开剂。丙酮∶苯∶乙醇∶氨水（20 ∶20 ∶5 ∶2）。

（5）检视。喷碘化铋钾显色剂，标准品与阳性样品应出现明显的橙红色斑点。

3.2.2 结果判断

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，不得显相同颜色的斑点。若显相同颜色的斑点，则为疑似阳性，待液-质联用法确证。

3.3 液-质联用法

3.3.1 标准曲线的制备

分别精密称取吗啡、那可汀、可待因、蒂巴因及罂粟碱对照品，吗啡用甲醇稀释成系列浓度40、50、100、200、300、400 ng·mL-1及500 ng·mL-1，可待因用甲醇稀释成系列浓度40、50、100、200、300、400、500、1 000 ng·mL-1及2 500 ng·mL-1，罂粟碱、蒂巴因和那可汀用甲醇稀释成系列浓度2、4、8、10、20、40、60、80 ng·mL-1及100 ng·mL-1，分别精密吸取标准溶液各5μL，注入液-质联用仪分析后得到不同浓度的峰面积，以峰面积为纵坐标，罂粟壳生物碱浓度（ng·mL-1）为横坐标，分别进行线性回归分析。

3.3.2 样品溶液的制备

称取样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL 聚四氟乙烯具塞离心管中，加水5 mL，振摇使之分散均匀（有些不易摇散的样品，必要时可加水10 mL），加入乙腈15 mL，涡旋振荡1 min，加入6 g 无水硫酸镁和1.5 g 无水乙酸钠的混合粉末，迅速振摇。涡旋振荡 1 min，以4 000 r·min-1离心5 min，精密量取上清液 10 mL，用经活化的C18小柱净化，用10 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至干，用甲醇定容至2 mL，经 0.22 μm 滤膜过滤，待测。

3.3.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂（规格为2.1 mm×100 mm，5 μm），柱温40 ℃，流速 0.2 mL·min-1，检测波长：250 nm，扫描波长范围 200 ～400 nm，进样量5 μL，以乙腈为流动相A，0.01 mol·L-1乙酸铵溶液（pH4.3）为流动相B，按表3进行梯度洗脱。

表3 洗脱条件表

3.3.4 质谱条件ESI 离子源干燥气温度300 ℃，干燥气流速11 L·min-1，毛细管电压4 000 V，正扫描模式，MRM 多反应监测，待测化合物监测母离子、子离子、碎裂电压及碰撞能等质谱参数见表4。

表4 待测化合物的质谱参数表

3.3.5 测定法

分别精密吸取供试品溶液和标准曲线溶液各 5 μL，注入液-质联用仪，记录色谱图。

3.3.6 结果判断

供试品色谱中，应不得出现与标准品色谱保留时间一致的色谱峰。若出现保留时间相同的色谱峰，则相应的一级质谱及二级质谱均不得与对照品一致。若色谱图、一级质谱及二级质谱均与对照品一致，结果判定为阳性。阳性结果按式（1）定量计算。

式（1）中：X—试样中待测组分的含量，单位为mg·kg-1。

ρ—从标准曲线得到的试样中待测组分的含量，单位为ng·mL-1。

V—试样的体积，单位为mL。

m—试样的质量，单位为g。

n—样品稀释倍数。

计算结果保留三位有效数字，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

3.3.7 线性关系考察

按2.2.3 做标准曲线，进行线性回归，吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀的线性方程及相关系数如表5 所示。

表5 吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可汀的回归方程表

3.3.8 定量限

将已知低浓度的罂粟壳生物碱对照品溶液，按3.3.3 至3.3.6 所述方法测定，以信噪比（S/N）为10 ∶1 时的浓度为定量限（LOQ），吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因及那可汀的定量限分别为2.4×10-2、2.4×10-2、6×10-4、6×10-4mg·kg-1及6×10-4mg·kg-1。

3.3.9 精密度

将混合标准品连续进样6 次，记录其峰面积，精密度用峰面积变化的相对标准偏差（RSD）表示，吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因和那可汀的峰面积的RSD 值分别为1.32%、4.63%、1.11%、0.56%及1.77%，RSD均小于5%，表明精密度良好。

3.3.10 稳定性试验

在室温条件下，将同一份样品溶液每隔一段时间（0、2、4、8 h 及12 h）测定一次，计算吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因且那可汀峰面积变化的相对标准偏差（RSD），分别为3.38%、1.38%、4.44%、4.99%及3.60%。说明样品在12 h 内稳定性好。

3.3.11 回收率试验

分别精密称取相同质量的样品10 份，一份不加标准品，作为测定本底值的样品。另外9 份分别加入高、中、低3 种浓度的标准品制备供试液，每种浓度重复3 次，计算其样品加标回收率，吗啡的平均加标回收率是78.28%～103.62%，可待因的平均加标回收率是80.86%～108.80%，罂粟碱的平均加标回收率是84.21%～101.61%，蒂巴因的平均加标回收率是74.63%～96.40%，那可汀的平均加标回收率是 76.26%～91.08%。表明本法准确度良好。